Главная
страница 1страница 2 ... страница 4страница 5
Белорусская медицинская академия последипломного образования

Кафедра детских инфекционных болезней




Клинические аспекты

лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции

Минск 2007

УДК 616.98:578.828.6-074

ББК 55.148

Г 61



Рецензент:

Еремин В.Ф., д.м.н., руководитель отдела клинической вирусологии, руководитель лаборатории диагностики ВИЧ и сопутствующих инфекций ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РБ



Голобородько Н.В., Ключарева А.А.

Клинические аспекты лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Пособие для практических врачей. – Мн.: БелМАПО, 2007. – хх с.

В пособии рассмотрены клинические аспекты лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, касающиеся постановки диагноза, слежения за ее течением, назначения и мониторинга эффективности антиретровирусной терапии.


Пособие предназначено для инфекционистов и врачей других специальностей, которые занимаются ведением пациентов с ВИЧ-инфекцией.
Пособие предназначено исключительно для образовательных целей и не заменяет рекомендаций национальных протоколов по ведению пациентов с ВИЧ-инфекцией.
Пособие составлено на основе лекций по ВИЧ-инфекции, которые читаются на курсах повышения квалификации «Лечение и профилактика ВИЧ-инфекции» и «ВИЧ-инфекция и парентеральные гепатиты» на кафедре детских инфекционных болезней БелМАПО, а также на основе данных литературных источников, указанных в списке литературы, приведенном в конце пособия. Материалы пособия в виде презентации лекции в формате PowerPoint можно заказать по электронной почте m_hol@tut.by.
Пособие подготовлено при технической поддержке странового офиса ВОЗ в Республике Беларусь и выпущено в свет при финансовой поддержке …

УДК 616.98:578.828.6-074

ББК 55.148
© БелМАПО, 2007

© страновой офис ВОЗ в Республике Беларусь, 2007



Содержание
Список сокращений
1 Введение

1.1 Задачи лабораторной диагностики при ВИЧ-инфекции

1.2 Строение ВИЧ: что же мы определяем лабораторно?

1.3 Естественное течение ВИЧ-инфекции: клинико-лабораторные параллели

1.4 Лекарственная резистентность ВИЧ

1.5 Тесты для лабораторной диагностики при ВИЧ-инфекции


2 Лабораторные тесты

2.1 Иммуноферментный анализ

2.2 Иммуноблотинг

2.3 Быстрые тесты

2.4 Полимеразная цепная реакция

2.5 Определение количества CD4 лимфоцитов

2.6 Определение лекарственной резистентности

2.7 Забор, хранение и транспортировка материала


3 Клиническое использование результатов тестов

3.1 Определение ВИЧ-статуса

3.2 Снижение порога доступа к тестированию на ВИЧ

3.3 Определение лабораторных маркеров у пациентов, не получающих АРТ

3.4 Лабораторные данные в определении показаний к АРТ

3.5 Лабораторные данные в контроле эффективности АРТ

3.6 Определение лекарственной резистентности в выборе схемы АРТ

3.7 Лабораторные данные в выборе тактики ведения ВИЧ-позитивных беременных


Заключение
Приложение Классификация АРВ препаратов
Литература
Список сокращений
Ab антитела (от англ. antibody)

Ag антиген (от англ. antigen)

CD4 лимфоциты CD4-позитивные Т-лимфоциты хелперы

CDC Centers for Diseases Control and Prevention (Центры контроля и профилактики заболеваний США)

CI доверительный интервал

DHHS Department of Health and Human Services (Министерство здравоохранения и социальных служб США)

EuroGuidelines Group EuroGuidelines Group for HIV Resistance (Европейская группа по разработке клинических рекомендаций по резистентности ВИЧ)

IAS-USA International AIDS Society-USA (Международное общество борьбы со СПИДом)

IDSA Infectious Diseases Society of America (Американское общество инфекционистов)

lg десятичный логарифм (1 lg=10, 2 lg=100 и т.д.)

tо температура

VL, ВН вирусная нагрузка (от англ. viral load)

АРВ антиретровирусный

АРТ антиретровирусная терапия

ВИЧ вирус иммунодефицита человека

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ИБ иммунный блотинг

ИФА иммуноферментный анализ

ПМР передачи ВИЧ от матери ребенку

ПЦР полимеразная цепная реакция

РНК рибонуклеиновая кислота

СПИД синдром приобретенного иммунодефицита

1 Введение
Врачам-клиницистам при тестировании пациентов на ВИЧ-инфекцию и при ведении ВИЧ-инфицированных пациентов постоянно приходится сталкиваться с вопросами назначения и интерпретации лабораторных тестов. Это может вызвать затруднения у врачей, имеющих небольшой опыт работы в данной проблеме.

В настоящем пособии рассмотрены клинические аспекты лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, касающиеся постановки диагноза, слежения за ее течением, назначения и мониторинга эффективности антиретровирусной терапии (АРТ). Вопросы лабораторной диагностики оппортунистических инфекций оставлены за рамками настоящего пособия.


1.1 Задачи лабораторной диагностики при ВИЧ-инфекции

Лабораторная диагностика при ВИЧ-инфекции направлена на решение двух основных задач:



  1. определить ВИЧ-статус пациента (инфицирован /не инфицирован ВИЧ);

  2. следить за течением ВИЧ-инфекции и выбирать тактику ведения ВИЧ-позитивного пациента (путем определения стадии ВИЧ-инфекции и прогноза ее течения, формулировки показаний к назначению медикаментозной профилактики оппортунистических инфекций и АРТ, а также проведения контроля эффективности АРТ).


1.2 Строение ВИЧ: что же мы определяем лабораторно?

ВИЧ – сложный РНК-содержащий вирус. Как видно из рис. 1, ВИЧ состоит из нуклеокапсида (включающего 2 нити минус РНК, вирусные ферменты и структурные оболочечные белки) и суперкапсида (липидная оболочка с включенными в нее гликопротеидами).



Рис. 1. Строение ВИЧ
ВИЧ относится к семейству ретровирусов, подсемейству лентивирусов, имеет 2 типа (распространенный ВИЧ-1 и более редкий ВИЧ-2) и субтипы, объединенные в группы, – М-группа (суптипы от А до К) и редкие О- и N- группы.

В клинической практике доступны тесты для выявления:



  • нуклеиновых кислот ВИЧ: РНК вирусов, находящихся в плазме, и ДНК ВИЧ, интегрированной в геном клетки хозяина, а также определение последовательности нуклеотидов в нуклеиновой кислоте ВИЧ;

  • вирусных белков, например, р24 антигена;

  • антител к ВИЧ: общих и антител к отдельным белкам вируса.

Кроме того, к понятию лабораторной диагностики ВИЧ традиционно относят определение количества CD4 лимфоцитов плазмы крови, как основной клетки-мишени, поражаемой ВИЧ.

Исследование генетической однородности субтипов ВИЧ, выделенных от различных источников, использует иммуноэпидемиология для слежения за циркуляцией штаммов ВИЧ в популяциях. В Беларуси циркулирует главным образом ВИЧ-1 субтипов А, В и рекомбинантного А/В.


1.3 Естественное течение ВИЧ-инфекции: клинико-лабораторные параллели

Схема естественного течения ВИЧ-инфекции представлена на рис. 2.


Рис. 2. Естественное течение ВИЧ-инфекции


После заражения ВИЧ вирус разносится макрофагами лимфогенным путем по организму и уже на 1-5 сутки от момента заражения определяется в крови. С этого времени вновь инфицированный ВИЧ человек становится заразным для окружающих. Вирус активно размножается в крови и вскоре отмечается максимальный пик виремии (VL, красная линия на графике).

В среднем через 10-14 дней от заражения (у некоторых пациентов – через 3–4 недели, а в отдельных случаях – через период до 6 месяцев) организм в ответ на внедрение вируса развивает специфический иммунный ответ, и в крови появляются антитела к ВИЧ (Ab, голубая пунктирная линия на графике). Антитела нейтрализуют большую часть вирусов, и виремия резко снижается. Период от появления виремии до появления специфических антител называется «серологическим окном». В этот период человек представляет высокую заразность (т.к. виремия максимальна), а диагностировать у него ВИЧ можно только с помощью тестов, определяющих антигены или нуклеиновую кислоту ВИЧ (т.к. антитела отсутствуют).

В период максимальной виремии у ВИЧ-инфицированного пациента могут появится клинические проявления острой ВИЧ-инфекции (острый ретровирусный синдром), чаще в виде гриппоподобного или мононуклеозоподобного синдромов.

После снижения виремии и исчезновения симптомов острой ВИЧ-инфекции наступает обычно длительная асимптомная стадия. Клинических симптомов ВИЧ-инфекции нет или они минимальны (например, лимфаденопатия). Вместе с тем, в организме ежедневно образуются миллиарды новых вирусов и иммунная система напряженно работает, удаляя их. Виремия в этот период минимальна (вплоть до неопределяемой), может незначительно повышаться на фоне общего ослабления организма (например, во время острой респираторной инфекции или вакцинации), но затем снова снижается. Количество CD4 лимфоцитов плазмы крови (основная клетка-мишень, поражаемая ВИЧ) в пределах нормальных значений.

Через годы клинической латенции наступает момент срыва компенсаторного механизма удаления вновь синтезируемых вирусов их организма, и количество вируса в крови растет. Неконтролируемое поражение вирусами CD4 лимфоцитов в конечном итоге приводит к снижению количества CD4 лимфоцитов в плазме крови – развитию Т-клеточного иммунодефицита. Появляются клинические проявления иммунодефицита, то есть наступают симптомные стадии ВИЧ инфекции (на графике обозначены как пре-СПИД и СПИД). Определение момента начала прогрессирования ВИЧ-инфекции (по клиническим и иммунологическим критериям) важно для своевременного старта лечения АРТ.
1.4 Лекарственная резистентность ВИЧ

Под лекарственной резистентностью понимают устойчивость ВИЧ к АРВ препаратам.

Причинами формирования резистентности являются: 1) высокая генетическая вариабельность популяции ВИЧ и относительная подвижность этих вариантов в присутствии одного или более АРВ препаратов и 2) присутствие АРВ препаратов в субоптимальной концентрации, создающей селективное давление. Лекарственная резистентность формируется только при сочетании двух этих факторов (репликации вируса при наличии субоптимального лекарственного пресса), что обычно наблюдается в условиях некачественного проведения АРТ при низкой приверженности пациента к лечению.

Резистентность подразделяют на первичную, которая определяется у АРТ-наивных пациентов (т.е. вирус имеет резистентность уже к моменту инфицирования человека), и вторичную, которая развивается в процессе применения АРТ у данного конкретного пациента. Частота первичной резистентности зависит от интенсивности предшествующего применения АРТ в отдельном регионе, в развитых странах в среднем составляя 10-20%. Частота первичной резистентности более 5% считается высокой.

Главная причина формирования резистентности ВИЧ к АРВ препаратам в процессе АРТ – это неадекватная приверженность пациента к лечению.

Клиническими последствиями развития резистентности в процессе АРТ являются констатация вирусологической неэффективности текущей схемы АРТ, появление ограничений в последующем выборе препаратов и возможность передачи резистентных штаммов в популяции.

Развитие резистентности в процессе АРТ зависит от генетического барьера препаратов (числа мутаций, необходимых для развития резистентности) и коэффициента ингибирования ВИЧ препаратами (показателя, отражающего насколько легко при снижении концентрации препарата происходит вхождение в зону селективного давления, где развиваются мутации резистентности). Число мутаций, необходимых для развития резистентности, составляет: для всех ННИОТ и 3TC – единичная мутация (быстрое развитие резистентности), для большинства НИОТ и некоторых ИП – 2-4 мутации (среднее развитие), для многих ИП (LPV/r, ATV, DRV) – 5 и более мутаций (медленное развитие). Низкий генетический барьер имеют препараты ННИОТ, высокий – ИП, очень высокий – бустированные ритонавиром ИП.

Стартовая схема АРТ должна иметь максимальную эффективность, в том числе и с позиций возможного развития резистентности.

При отмене АРВ препарата, к которому развилась резистентность, мутантный штамм ВИЧ перестает быть доминантным, поэтому при лабораторном исследовании может перестать определяться. Но это наблюдаемое «восстановление чувствительности к препарату» является весьма относительным, поскольку при возобновлении приема данного препарата сохраняющиеся в департментах мутантные штаммы могут получить конкурентное преимущество и снова перейти в доминантное состояние. Вероятно поэтому повторное назначение того же АРВ препарата значительно менее эффективно, чем первое назначение.
1.5 Тесты для лабораторной диагностики при ВИЧ-инфекции

К тестам для лабораторной диагностики при ВИЧ-инфекции можно отнести:

1) тесты для постановки диагноза ВИЧ-инфекции:


  • скрининговые для определения антител к ВИЧ (антител и антигенов ВИЧ): иммуноферментный анализ (ИФА), быстрые тесты;

  • подтверждающие для определения антител к ВИЧ: иммунный блотинг (ИБ);

  • методы амплификации нуклеиновых кислот ВИЧ: качественная ПЦР (ДНК-ПЦР) в культуре лимфоцитов крови;

2) тесты для слежения за течением ВИЧ-инфекции:

  • методы амплификации нуклеиновых кислот ВИЧ: количественная ПЦР (РНК-ПЦР, вирусная нагрузка) в плазме;

  • определение иммунного статуса: CD4 лимфоциты в плазме крови;

3) тесты для определения лекарственной резистентности.
Выделение культуры вируса в клинической практике практически не используется (применяется обычно в исследовательских целях), поэтому в данную классификацию данный метод не включен.

Ниже будут более подробно рассмотрены указанные тесты для лабораторной диагностики при ВИЧ-инфекции, а затем – их клиническое применение.



2 Лабораторные тесты
2.1 Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА, англ. – EIA или ELISA) подразумевает определение суммарных антител и/или антигенов ВИЧ в биологических жидкостях.


Биологические жидкости, в которых можно определять антитела к ВИЧ:

  • сыворотка крови, полученная путем центрифугирования цельной крови, – наиболее распространено определение антител именно в сыворотке крови;

  • цельная капиллярная кровь, взятая из пальца;

  • транссудат слизистой полости рта, собранный с помощью специальной пластинки (тесты OraSure, Oral Fluid, OMT-EIA);

  • моча (быстрый тест Calypte HIV-1 Test для постановки врачом);

  • вагинальные выделения (быстрый тест Wellcozyme для определения IgG у жертв изнасилования).

Принцип метода ИФА-диагностики представлен на рис. 3.



Рис. 3. Принцип постановки иммуноферментного анализа (ИФА)
Существуют несколько поколений тестов для ИФА (табл. 1). Тесты всех поколений выявляют общие (суммарные) антитела к ВИЧ, а тесты 4 поколения – еще и р24 антиген ВИЧ («комбинированный тест»).
Таблица 1 – Характеристика тестов для ИФА различных поколений

поколение тестов

определение Ab

определение Ag

первое

основаны на нативном вирусе

нет

второе

основаны на рекомбинантных белках или синтетических пептидах

нет

третье

в качестве конъюгата меченные белки ВИЧ

нет

четвертое

в качестве конъюгата меченные белки ВИЧ

определяют р24 антиген

В Беларуси в последнее время применяются ИФА тесты 3 и 4 поколений. Они обладают высокой чувствительностью – приближающейся к 100% (то есть вероятность получения ложноотрицательного результата практически исключается) и чуть более низкой специфичностью – около 98-99% (то есть у небольшой части обследованных, до 2%, результат будет ложноположительным). Поэтому ИФА считается не диагностическим, а скрининговым тестом, и при получении положительного результата ИФА-теста следует провести подтверждающий тест (иммуноблотинг).

ИФА тесты 4 поколения позволяют выявить кровь ВИЧ-позитивного человека уже вскоре после появления виремии, включая большую часть периода «серологического окна», когда антитела еще не наработаны, но в крови уже имеется р24 антиген (рис. 4). Поэтому в Беларуси ИФА тесты 4 поколения используются при тестировании донорской крови.

Рис. 4. Возможности различных тестов в раннем выявлении ВИЧ-инфекции [цит. по Р.Торстенссону, Шведский институт по контролю за инфекционными заболеваниями, 2005]


Определение р24 антигена ранее (до появления ДНК ПЦР) применяли также для диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных ВИЧ-позитивными матерями, поскольку у таких детей в первые месяцы жизни (до 18 месяцев) могут циркулировать как собственные, так и материнские антитела, следовательно, определение антител не имеет большой информативности. Также определение р24 антигена использовали в качестве экономичного способа определения вирусной нагрузки в условиях ограниченных ресурсов.
2.2 Иммуноблотинг

Иммуноблотинг (ИБ, англ. – western blot, WB) подразумевает определение антител к отдельным белкам ВИЧ в биологических жидкостях.

По своей сути метод ИБ схож с ИФА. Отличие состоит в том, что сыворотку пациента добавляют не в лунку с адсорбированным «общим» антигеном ВИЧ, а вносят на панель с отдельными вирусными белками, которые предварительно были электрофоретически «разогнаны» на отдельные фракции сообразно их молекулярной массе. То есть в результате постановки ИБ мы получаем заключение о наличии в образце не общих антител к ВИЧ, а антител к отдельным белкам ВИЧ-1, в том числе к белкам сердцевины вируса (p17, p24, p55), гликопротеинам оболочки (gp41, gp120, gp160) и ферментам (p31, p51, p66).

Принцип метода ИБ представлен на рис. 5.






  1. Электрофоретическое разделение белков ВИЧ-1 (стандартный реагент) по их молекулярной массе

  2. Инкубация с добавлением исследуемой сыворотки – специфическое соединение белков ВИЧ с соответствующими отдельными антителами к ВИЧ из добавленной сыворотки

  3. Инкубация с добавлением меченных ферментом антител к человеческим Ig

  4. Детекция окрашенных полос



Рис. 5. Принцип постановки иммуноблотинга (ИБ) [цит. по Э. Фаучи, К. Лэйн, 2003]


Критериями положительного результата ИБ являются:

  • по ВОЗ: сочетание 2 полос, соответствующих gp41 и gp120/gp160;

  • по CDC/APHL: сочетание 2 полос, соответствующих любым 2 из 3 антигенов ВИЧ – p24, gp41, gp120/gp160.

Критерием отрицательного ИБ является отсутствие полос.

Критерием неопределенного ИБ является наличие любых полос, сочетание которых не удовлетворяет критериям положительного результата.

Трактовку результатов ИБ осуществляет врач-лаборант, который выдает клиницисту заключение «ИБ положительный» или «ИБ отрицательный». Примеры интерпретации результатов ИБ приведены на рис. 6.



  1. Положительный ИБ к ВИЧ-1

  2. Отрицательный ИБ (у здорового человека, иммунизированного белками внешней оболочки ВИЧ-1)

  3. Сомнительный ИБ (у инфицированного ВИЧ-2)

  4. Сомнительный ИБ (наличие антител, перекрестно реагирующих с p24 Ag)

  5. Отрицательный ИБ



Рис. 6. Трактовка результатов иммуноблотинга (ИБ) [цит. по Э. Фаучи, К. Лэйн, 2003]


Тесты для ИБ более дороги, чем для ИФА, но обладают значительно более высокой специфичностью. Поэтому ИБ не применяется для скрининга, а является подтверждающим тестом при получении положительного результата в ИФА. При проведении обследования пациента, от момента заражения которого прошло 3 месяцев, по стандартной методике с двукратным тестированием в ИФА и подтверждением в ИБ чувствительность составляет 99,5% (95%CI 98-99,9%), а специфичность – 99,994%.

Ложноотрицательные результаты определения антител к ВИЧ в ИФА/ИБ у некоторых пациентов (около 0,3% в популяциях с высокой распространенностью ВИЧ-инфекции и <0,001% в популяциях с низкой распространенностью) обусловлены возможностью затягивания периода «серологического окна» до 6 месяцев, появления серореверсии на поздних стадиях ВИЧ-инфекции или у длительно получающих АРТ пациентов, идиопатической «атипичной иммунной реакцией», агаммаглобулинемией, инфицированием штаммом ВИЧ-2 или ВИЧ-1 О- или N- групп, а также возможностью технической или канцелярской ошибки.

Ложноположительные результаты определения антител к ВИЧ в ИФА/ИБ являются казуистикой (частота встречаемости 0,0004-0,0007%) и могут быть обусловлены появлением аутоантител, обнаружением поствакцинальных антител (у пациентов, участвующих в клинических испытаниях вакцин против ВИЧ), а также возможностью технической или канцелярской ошибки. Ложноположительный результат можно заподозрить, если у пациента отсутствуют факторы риска инфицирования ВИЧ, не определяется вирусная нагрузка и показатели количества CD4 лимфоцитов в пределах нормы. В этом случае серологическое обследование следует провести повторно.

Кроме всего прочего, пациенты могут сообщать врачу ложные сведения о якобы отрицательных результатах теста на ВИЧ (что наблюдается достаточно часто при фиксировании пациента на «стадии отрицания» нормальной реакции принятия диагноза) или о якобы положительных результатах теста (пациенты с синдромом Мюнхгаузена).

Неопределенные результаты ИБ получают достаточно часто – в 4-20% случаев. Неопределенный результат ИБ может быть обусловлен обследованием во время сероконверсии (обычно первыми появляются антитела к р24, затем – другие) или на поздних стадиях ВИЧ-инфекции (когда обычно исчезают антитела к белкам сердцевины), при наличии перекрестно реагирующих неспецифических антител (при коллагенозах, васкулитах, других аутоиммунных заболеваниях, лимфомах, заболеваниях печени, инъекционном потреблении наркотиков, рассеянном склерозе, во время беременности и после недавней иммунизации), при инфицировании штаммом ВИЧ-2 или ВИЧ-1 О- или N- групп, при обнаружении поствакцинальных антител (у пациентов, участвующих в клинических испытаниях вакцин против ВИЧ), а также возможностью технической или канцелярской ошибки.

При получении неопределенного результата ИБ рекомендуется оценить риск инфицирования ВИЧ у данного пациента, провести повторное серологическое тестирование (у не имеющих риска инфицирования пациентов – через 3 месяца, у имеющих риск инфицирования пациентов – через 1, 2 и 6 месяцев) и предложить пациенту принимать меры по профилактике передачи вируса вплоть до подтверждения его отсутствия. В спорных случаях возможно тестирование на наличие ДНК ВИЧ в качественной ПЦР (см. ниже).


следующая страница >>
Смотрите также:
Клинические аспекты лабораторной диагностики вич-инфекции
672.67kb.
5 стр.
Профилактика вич-инфекции
48.41kb.
1 стр.
Урок о вич-инфекции, приуроченный ко Дню памяти людей, умерших от спид
37.17kb.
1 стр.
I. вввдение о риске заражения вич на рабочем месте известно с 1984 года, когда появилось первое сообщение о вич-инфекции, приобретенной медицинским работником в результате трав­мы от инъекции (Апопутоиз, 1984). С тех пор
175.2kb.
1 стр.
Программа развития ООН улучшение системы обучения лечению вич/спида в Республике Беларусь
258.18kb.
1 стр.
Анализ эпидемической ситуации по вич инфекции
228.79kb.
1 стр.
Инструкция по заполнению отчетной формы ежемесячного наблюдения по реализации приоритетного национального проекта «Сведения о мероприятиях по профилактике вич-инфекции, гепатитов в и С, выявлению и лечению больных вич»
235.6kb.
1 стр.
Основные тенденции развития эпидемии вич/спид в Минской области. Выполнение мероприятий Государственной программы профилактики вич-инфекции на 2011-2015 годы
117.16kb.
1 стр.
Основные тенденции развития эпидемии вич/спид в Минской области. Выполнение мероприятий Государственной программы
106.06kb.
1 стр.
Анализ эпидситуации по вич инфекции за февраль 2011 год
196.23kb.
1 стр.
Анализ эпидситуации по вич инфекции за январь 2013 год
187.18kb.
1 стр.
-
748.56kb.
5 стр.