Проблемы здоровья и экологии

Поступила 28.03.2005

УДК 575.1

ХАРАКТЕРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ ДНК

ИЗ патогенных и сапрофитных ГРИБОВ КЛАССОВ Ascomycetes,

BAsidiomycetes и deuteromycetes

М.Я. Острикова, О.Ю. Баранов

Гомельский государственный медицинский университет

Институт леса

Предложен быстрый микрометод выделения препаратов суммарной ДНК из грибов родов Candida, Aspergillius, Pleurotus и Lentinus. Установлено, что полученные микропрепараты ДНК грибов характеризуются высокой степенью чистоты и отсутствием деградации.

Ключевые слова: ДНК, Aspergillius, Candida, Pleurotus, Lentinus

CHARACTERISTIC FEATURES OF ISOLATION OF TOTAL DNA

FROM PATHOGENIC AND SAPROPHYTE Ascomycetes

BAsidiomycetes AND deuteromycetes FUNGES

M.Ya. Ostrikova, O.Yu. Baranov

Gomel State Medical University

Institute of Forest

The micromethod of rapid preparation of DNA samples from fungi genus Candida, Aspergillius, Pleurotus и Lentinus have been developed. Showed, that prepared samples of DNA have high quality of clearness and no visual degradation.

Key words: DNA, Aspergillius, Candida, Pleurotus, Lentinus.

Введение

К настоящему времени методы анализа ДНК [2, 3, 4] нашли широкое практическое применение в различных областях медицины: изучение и определение врожденных заболеваний на различных стадиях онтогенеза; выявление и типировка инфекционных возбудителей in vitro и in vivo; исследование геномов и классификация штаммов микроорганизмов [3, 5], используемых для получения лекарственных средств и др. Для большинства используемых технологий первоначальным этапом анализа является выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты из изучаемых объектов [1, 5]. Важным требованием, предъявляемым к стадии экстракции, является получение препаратов ДНК, характеризующихся высокой степенью чистоты и отсутствием деградации [1, 5]. Данное условие может быть выполнено лишь при учете биохимических особенностей строения изучаемого объекта и подборе оптимальных условий, препятствующих разрушению и изменению структуры молекулы ДНК. Кроме того, используемая методика должна характеризоваться быстотой и экономичностью [1].

Целью данной работы явилась разработка методики выделения ДНК из мицелия грибов родов Aspergillius, Candida, Pleurotus, Lentinus.

Материалы и методы

В качестве исследуемых объектов использовались грибы родов Aspergillus и Candidа, культивируемые на кафедре микробиологии, иммунологии, вирусологии Гомельского государственного медицинского университета; родов Pleurotus и Lentinus, предоставленных сектором микологии и культивирования съедобных грибов Института леса НАН Беларуси.

Выделение ДНК грибов производилось на основе технологии спиртового осаждения нуклеиновых кислот из их растворов [1, 5] с модификациями.

Гомогенизация и экстракция. Для этого навеску образца массой 4–7 мг помещали в центрифужную пробирку типа «Eppendorf» объемом 0,5 мл, содержащую 100 мкл экстрагирующего буфера следующего состава: 200 мМ р-р солянокислого триса, рН 7,5, 250 мМ р-р хлорида натрия, 25 р-р мМ трилона Б, 0,5% лаурилсульфата натрия. Далее, используя прокаленные стеклянные пестики, производили гомогенизацию материала при комнатной температуре в течение 30–40 с. По окончании гомогенизации пробирку с растертыми образцами закрывали и встряхивали на вихревом смесителе (400–600 мин^-1) в течение 5 с. После этого пробирки помещали во встряхивающую ванну (200 мин^-1) и инкубировали в течение 15 мин при 65°С.

Очистка гомогенатов. После экстракции в пробирку добавляли 70 мкл охлажденного 5 М р-ра ацетата калия (рН 5,0). Содержимое перемешивали на вихревом смесителе (400 мин^-1) и инкубировали на ледяной бане в течение 10 мин. После инкубации гомогенаты смешивали с 100 мкл хлороформа. Далее производили центрифугирование при 15000×g (Т = 4°С) в течение 20 мин.

Осаждение ДНК. По окончании центрифугирования пипеткой отбирали 150 мкл супернатанта и переносили в другую центрифужную пробирку типа «Eppendorf» объемом 0,5 мл и добавляли 130 мкл охлажденного изопропанола. После добавления спирта содержимое пробирки перемешивали на вихревом смесителе (600 мин^-1) и оставляли в роторе центрифуги на 5 мин. Далее производили центрифугирование при 15000×g (Т = 0°С) в течение 10 мин.

Очистка препарата ДНК. Супернатант сливали, а полученный осадок ДНК промывали 250 мкл 65% этанола, охлажденного при –20°С. После промывания содержимое пробирок центрифугировали при 15000×g (Т = 4°С) в течение 10 мин. Процедуру промывки проводили 2–3 раза для удаления из осадка остатков трилона Б, а также изопропанола.

Лиофилизация препарата ДНК. После промывки этанолом пробирки размещали в штативе и, открыв крышки, просушивали осадок ДНК в течение 30–40 мин (Т = 45°С) до полного испарения этанола.

Растворение препарата ДНК. Высушенный осадок растворяли в 20 мкл деионизированной воды во встряхивающей ванне (200 мин^-1) при 65°С в течение 30 мин. Далее проводили спектрофотометрические измерения для определения концентрации и степени чистоты полученных препаратов ДНК.

Измерение при 260 нм позволяет рассчитать концентрацию нуклеиновой кислоты в пробе. Оптическая плотность D = 1 соответствует приблизительно 50 мкг/мл двухцепочечной ДНК. Соотношение экстинций 260нм / 280нм позволяет судить о чистоте нуклеиновой кислоты. Чистые препараты ДНК имеют соотношение не менее 1,65.

Электрофоретическое фракционирование проводили используя 0,7%-ный агарозный гель в 1,5×ТВЕ буфере [5]. Затем окрашивали этидиум бромидом и фотодокументировали.