Поиск сайтов связывания транскрипционных факторов

Для поиска потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов in silico, как правило, используют матрицы позиционных весов [44]. Обучающей выборкой для матрицы является выравнивание нуклеотидных последовательностей известных сайтов связывания. Каждый элемент такой матрицы есть функция от частоты встречаемости данного нуклеотида в данной позиции в обучающей выборке. Например, в программе SignalX из пакета программ GenomeExplorer [1] используется следующая формула для веса нуклеотида b в позиции k:

,

где N_b,k – количество появлений нуклеотида b в позиции k. В ходе поиска сайтов в геноме для каждой последовательности нуклеотидов нужной длины подсчитывается вес, который определяется как сумма весов всех нуклеотидов. Потенциальными сайтами считаются лишь те последовательности, вес которых превышает заданное пороговое значение. Вес сайта зависит от его длины, поэтому имеет смысл сравнивать веса сайтов одинаковой длины. Одним из ограничений подхода является то, что матрицы позиционных весов не учитывают взаимодействие между позициями, и каждая позиция оценивается независимо.

Существуют и другие методы поиска сайтов в геноме. Ранее использовался поиск по консенсусу. Консенсус мотива – последовательность, в каждой позиции которой находится наиболее часто встречающийся в данной позиции мотива нуклеотид. При использовании данного метода вес сайта является функцией от числа совпадений сайта с консенсусом мотива. Распространение получили методы предсказания сайтов с неизвестной заранее последовательностью нуклеотидов: гиббсовский семплер [29], MEME [5]. Их работа сводится к нахождению локального множественного выравнивания заданных последовательностей. Однако эти методы не подходят для полногеномного поиска сайтов и дают менее точные результаты по сравнению с матрицами позиционных весов для случаев, когда априори известна модель сайта.

3. Регуляция экспрессии транспортера Blt

У грамположительной бактерии B. subtilis экспериментально охарактеризован транспортер МЛУ Blt, относящийся к надсемейству MFS и включающий 12 трансмембранных альфа-спиралей. Транспортерами МЛУ называют транспортные белки, способные выводить из клетки широкий набор антимикробных соединений. Они играют существенную роль в выработке устойчивости многих видов бактерий к лекарственным средствам. Предполагают, что их клеточная роль состоит в выводе из клетки токсичных гидрофобных соединений, встречающихся в окружающей среде и проникающих в клетку путем пассивной диффузии [25]. Среди прокариотических транспортеров МЛУ выделяют 5 групп: надсемейства ABC (ATP binding cassette), MFS (major facilitator superfamily), и RND (resistance, nodulation and cell division) и семейства SMR (small multidrug resistance) и MATE (multigrug and toxic compound extrusion) [25]. Транспортеры надсемейства ABC используют в качестве источника энергии гидролиз АТФ, остальные же транспортеры МЛУ – протонный или натриевый градиент. Транспортер Blt способствует удалению из клетки родаминовых красителей, бромистого этидия [39], фторхинолонов, акридиновых красителей, тетрафенилфосфония, хлормицетина, пуромицина, нетропсина и доксорубицина [3, 38].

Транскрипцию гена blt, кодирующего этот транспортер, активирует белок BltR. Он принадлежит к семейству факторов транскрипции MerR. В одном опероне с blt расположен ген, кодирующий ацетилтрансферазу BltD (рис. 1). Ген, кодирующий регулятор BltR, расположен в одном локусе с регулируемыми генами. Фермент BltD катализирует реакцию ацетилирования полиаминов спермина и спермидина, что приводит к их последующей деградации [56]. Примечательно, что транспортер Blt выводит из клетки не только токсичные вещества, но и спермидин [34, 57]. Тем не менее, спермидин не является эффектором регулятора BltR [34]. Роль полиаминов в метаболизме бактерий на настоящий момент полностью не выяснена. В частности, к их функциям относятся стабилизация РНК и ДНК, реакция на окислительный стресс и повышенную кислотность, биосинтез сидерофоров, выработка вирулентности, образование биопленок и пр. [47, 49, 58]. Установлено, что полиамины необходимы Escherichia coli для нормальной скорости размножения [49]. Спермидин синтезируется бактериями из аминокислот аргинина, орнитина и метионина, тогда как спермин обычно поглощается из внешней среды [47, 49]. Известно, что в клетках Escherichia coli ацетилирование спермидина приводит к его деградации и стимулируется его избытком в клетке или среде, а также при низких температурах [49], тепловом шоке, пониженной кислотности и воздействии этанола [12].

Рисунок 1. Структура локуса blt [3]. Толстыми стрелками обозначены гены, тонкими стрелками показаны старты транскрипции, треугольником показан сайт связывания BltR.

Сайт связывания регулятора BltR расположен между элементами −35 и −10 промотора регулируемого оперона blt-bltD. Длина промежутка между этими элементами составляет при этом 19 п.н. вместо обычных 16-17 п.н. (рис. 2). Сайт связывания белка BltR представляет собой нестрогий палиндром длиной 17 п.н., частично перекрывающийся с −35 элементом промотора регулируемого гена. Такое расположение сайта связывания относительно промотора характерно и для других регуляторов семйства MerR, например, BmrR, который регулирует экспрессию транспортера МЛУ Bmr. Механизм активации транскрипции регулятором BmrR B. subtilis изучен экспериментально [37, 59]. При связывании лиганда с C-концевым доменом белка BmrR происходит расплетение одной из альфа-цепей белка и раскрытие внутреннего кармана, в котором отрицательно заряженный остаток глютамина образует высокоаффинную связь с положительно заряженной молекулой лиганда. При этом Bmr становится способным к димеризации и последующему связыванию с ДНК [60]. Молекула ДНК в комплексе эффектор-BmrR-ДНК изогнута, причем расстояние между промоторными элементами уменьшено на длину, эквивалентную 2 п.н. Такие же деформации ДНК наблюдаются и при связывании с ней других регуляторов семейства MerR – MtaN [23, 37], CueR, ZntR [13] и SoxR [55], гораздо менее сходных по аминокислотной последовательности с BltR, чем BmrR. Исходя из этого, можно предположить, что подобный принцип действия характерен и для BltR.

Рисунок 2. Структура промоторной области гена, blt [3]. Элементы промотора выделены рамками, палиндромный сайт связывания выделен синим цветом. Центр палиндрома отмечен стрелкой. Заглавные буквы отмечают позиции, удовлетворяющие условию обратной комплементарности.