Главная
страница 1страница 2страница 3


Федеральное агентство по образованию



УДК
ГРНТИ
Инв. №



ПРИНЯТО:

УТВЕРЖДЕНО:

Приемочная комиссия Государственного заказчика:



Государственный заказчик
Федеральное агентство по образованию




От имени Приемочной комиссии

___________/________ /





От имени Государственного заказчика

___________/________/






НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ
ОТЧЕТ


о выполнении 1 этапа Государственного контракта
№ П1706 от 23 сентября 2009 г.




Исполнитель: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт онкологии Сибирского отделения РАМН (НИИ онкологии СО РАМН)



Программа (мероприятие): Федеральная целевая программ «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.3.2 Проведение научных исследований целевыми аспирантами.



Проект: Молекулярно-цитогенетический профиль хромосомной изменчивости на ранних этапах злокачественной трансформации клеток эпителия желудка

Руководитель организации:
______________/Чойнзонов Е.Л.

(подпись) М.П.



Руководитель проекта:
______________/Матвеенко Ольга Альбертовна

(подпись) М.П.




Томск
2009 г.

РЕФЕРАТ


Отчет 37 с., 1ч., 0 рис., 0 табл., 40 источн., 0 прил.

Рак желудка, предраковое заболевание желудка, молекулярно-цитогенетические маркеры.


В отчете представлены результаты исследований, выполненных по 1 этапу Государственного контракта № П1706 «Молекулярно-цитогенетический профиль хромосомной изменчивости на ранних этапах злокачественной трансформации клеток эпителия желудка» (шифр «НК-366П») от 23 сентября 2009 по направлению «Физико-химическая молекулярная и клеточная биология» в рамках мероприятия 1.3.2. «Проведение научных исследований целевыми аспирантами» федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.
Цель работы - анализ спектра и уровня хромосомных аберраций в тканях ранних стадия рака желудка и предраковых заболеваний эпителия желудка.
Методы, использованные при выполнении отдельных видов работ по Государственному контракту: метод фенольной экстракции ДНК из операционных и биопсийных образцов.
Инструментарий, использованный при выполнении отдельных видов работ по Государственному контракту: морозильная камера «Sanyo», видеогастроскоп «GIF-Q160Z» с биопсийными щипцами, термостат лабораторный ТАТ ТВЗ-25, наборы для выделения ДНК из тканей человека «QIAamp DNA mini Kit» фирмы «Qiagen», лабораторная центрифуга с охлаждением для микропробирок «Эппендорф 5415R», микротермостат «БИС-205», миницентрифуга-вортекс для микропробирок «Biosan Microspin FV-2400», микродозаторы для дозирования микрообъемов жидкостей, установка для очистки воды «Milipore – Mili Q», низкотемпературная морозильная камера «Sanyo», pH-метр «Hanna Intrument - pHer+», персональный компьютер с доступом в интернет, ГОСТ 7.32-2001, база данных Pubmed по биомедицинским публикациям.
Результаты, полученные при выполнении отдельных видов работ по Государственному контракту: проведен аналитический обзор литературы по вопросу хромосомных нарушений в тканях предраковых заболеваний желудка и опухолевых тканей данного органа, исследованы вопросы эпидемиологии, патоморфологии и клинических-морфологических характеристик рака желудка. На базе клинического отдела НИИ онкологии СО РАМН был собран биопсийный и операционный материал ранних раков и предраковых заболеваний желудка (n=103). Сформированы две выборки: 34 образца опухолевых тканей и 69 образцов тканей предраковых заболеваний эпителия желудка. В ходе проделанной работы за 2009 год методом фенольной экстракции было выделено 65 образцов ДНК из опухолевых тканей и тканей предраковых заболеваний желудка, определена концентрация ДНК во всех 65 образцах. Подготовлена отчетная документация за первый этап выполнения научно-исследовательской работы.

Дополнений нет.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение 3

1. Аналитический обзор 7

1.1 Некоторые эпидемиологические, патоморфологические и

молекулярно-генетические аспекты рака желудка 7

1.2 Хромосомные нарушения в клетках линий рака желудка 10

1.3 Исследование хромосомных нарушений при раке желудка с

Помощью сравнительной геномной гибридизации 13

1.4 Новые технологии исследования хромосомных нарушений при

раке желудка 19

2. Выбор обоснованного варианта направления исследований 25

3. План проведения экспериментальных и теоретических

исследований 27

4. Результаты экспериментальных и теоретических исследований 28

Заключение 29

Список литературы 31
Проведение 1 этапа исследований по проблеме: Молекулярно-цитогенетический профиль хромосомной изменчивости на ранних этапах злокачественной трансформации клеток эпителия желудка
ВВЕДЕНИЕ

Злокачественные опухоли являются одной из главных причин заболеваемости, потери трудоспособности и смертности человека. Сегодня рак занимает третье место в мире по количеству вызываемых смертей после сердечно-сосудистых заболеваний и травм. Особенностями рака являются высокая частота возникновения, большой процент летальных исходов, а также наличие социального и экологического аспектов, влияющих на его возникновение и распространение.

Несмотря на значительное количество исследований данной патологии, улучшению диагностических возможностей и терапии опухолей, рак остается угрозой здоровью и жизни населения. На сегодняшний день благодаря изучению канцерогенеза, не вызывает сомнений мультифакториальная природа опухолей. Однако в основе патологических изменений в клетке и становлении ее на путь малигнизации лежат нарушения генома. Поскольку опухолевые клетки отличаются большой гетерогенностью по типам, уровню и характеру геномных нарушений, всегда существовал вопрос о первопричинности малигнизации клетки организма, какого типа изменения генома являются толчком в становлении нормальной клетки на путь раковой. Следует отметить, что в настоящее время существует несколько альтернативных точек зрения на эту проблему [12]. Согласно одной из них, наиболее популярной, опухолевые клетки возникают в результате накопления нескольких мутаций в генах-онкосупрессорах, белковые продукты которых обеспечивают поддержание стабильности генома, либо в онкогенах, ответственных за пролиферацию клеток. С другой стороны, есть мнение, что для возникновения опухоли должны произойти мутации в особых клеточных генах, ответственных за регуляцию таких ключевых процессов, определяющих стабильность генома, как регуляция клеточного цикла, репарация ДНК, апоптоз. При этом клетки приобретают так называемый «мутаторный фенотип», который характеризуется высоким уровнем геномной нестабильности. В результате подобные клетки становятся неспособными к репарации полученных повреждений и сами начинают индуцировать новые мутации [7]. В последнее время широкое распространение получила эпигенетическая концепция канцерогенеза, согласно которой в основе первичных процессов злокачественной трансформации клеток лежат нарушения эпигенетической организации хроматина - аномалии метилирования ДНК или ковалентных модификаций гистоновых белков [14]. Наконец существует гипотеза, согласно которой к множественным изменениям на геномном уровне может привести индуцированная различными канцерогенами анеуплоидия в соматических клетках, при которой одновременно возникает дисбаланс нескольких тысяч генов [11].

Рак желудка занимает особое место среди новообразований человека. Как причина смертности, данный тип неоплазии занимает четвертое место после рака легкого, опухолей молочной железы и рака кожи. Особенностями рака желудка являются высокая частота возникновения, отсутствие клинических проявлений на ранних стадиях заболевания, гетерогенность по гистологическим подтипам и наличие большого спектра хромосомных нарушений.

В большинстве случаев рак желудка развивается на фоне длительно существующих предопухолевых изменений слизистой. Предраковые изменения представляют собой морфологические повреждения эпителия и замещение нормальной слизистой на диспластическую. Однако в желудке выявляются также различные морфологические заболевания неонкогенной природы, такие как хронический атрофический гиперпластический гастрит, аденоматозные полипы, пернициозная анемия, состояния после резекции желудка, болезнь Менетрие. Установлено, что более 80% случаев дистального рака желудка связаны с инфекцией Helicobacter pylori и последующим гастритом [26]. Поэтому ввиду своей высокой распространенности и достаточно высокого злокачественного потенциала хронические, особенно атрофические, гастриты, спровоцированные Helicobacter pylori, вызывают особый интерес и нуждаются в ранней диагностике. Такие «фоновые» патологии могут способствовать появлению очага опухолевой инициации. Пациентов с такими заболеваниями включают в группы риска, ставят на диспансерный учет. Однако при этом, никакой превентивной предопухолевой терапии не проводится из-за отсутствия диагностических маркеров опухолевой трансформации для клинической диагностики предраковых заболеваний.

Кроме морфологических изменений предраковые заболевания характеризуются нарушениями хромосомного материала. Исследования хромосомных нарушений в клетках предраковых заболеваниях желудка, являющихся фактором риска развития опухоли, представляют большой научно-практический интерес, в связи с необходимостью более глубокого понимания процессов канцерогенеза желудка и, в последствие, адекватного выбора терапии для конкретного пациента. Исследования тканей предраковых заболеваний желудка, таких как атрофический гастрит, аденома с помощью молекулярно-цитогенетических методов также актуальны в связи с поисками генетических маркеров для ранней диагностики заболевания. Одним из используемых методов для исследования хромосомных нарушений является метод стандартной геномной гибридизации (Comparative genomic hybridization, CGH) разработанный в 1992 году A. Kallioniemi [15]. Данный метод представляет собой конкурентную гибридизацию эквимолярных количеств тестируемой и контрольной ДНК на нормальных метафазных пластинках здорового индивида. CGH обеспечивает детальное исследование всех несбалансированных структурных и числовых хромосомных нарушений в солидных опухолях в одной реакции гибридизации, исключая этап приготовления препаратов метафазных хромосом из исследуемой ткани.

Таким образом, выполнение данного научно-исследовательского проекта, позволит получить общую картину нарушений хромосомного материала в клетках данных патологических состояний с диспластическими изменениями, а также будет способствовать накоплению новых знаний о канцерогенных процессах на ранних стадиях развития неоплазии желудка до клинических проявлений опухоли. Кроме того, сравнение уровня и спектра хромосомных аберраций в клетках предраковых заболеваний желудка и зрелых опухолей, возможно, откроет механизмы клонального отбора диспластических клеток с определенным генетическим портретом, обеспечивающим быстрый рост и развитие опухоли, что определит выбор необходимой предопухолевой терапии для своевременного воздействия на морфологически измененные ткани эпителия желудка. Решение этих вопросов является актуальным направлением исследований в области изучения цитогенетики как злокачественных новообразований в целом, так и рака желудка в частности.

Целью настоящей работы является анализ спектра и уровня хромосомных аберраций в тканях ранних стадия рака желудка и предраковых заболеваний эпителия желудка.

Задачи данного исследования:


  1. Сформировать банк тканей и ДНК пациентов с ранними раками желудка и предраковыми заболеваниями данного органа

  2. Получить геномные ДНК-библиотеки (из анализируемой и контрольной ткани) меченые различными флуорохромами ДНК-зонды в ходе реакции ник трансляции

  3. Провести полногеномное молекулярно-генетическое профилирование тканей предраковых заболеваний с помощью сравнительной геномной гибридизации (CGH).

  4. Провести анализ увеличения и уменьшения числа копий ДНК в полученных CGH профилях

  5. Оценить вклад отдельных хромосомных нарушений в общую картину процессов инициации и прогрессии рака желудка

  6. Оценить возможность использования отдельных хромосомных аберраций в качестве маркеров для ранней диагностики рака желудка

  7. Оценить связь детектированных хромосомных нарушений с некоторыми клинико-морфологическими параметрами

В ходе выполненной работы будут впервые охарактеризованы хромосомные аберрации в клетках тканей предраковых заболеваний желудка, получены данные об уровне и спектре нарушений хромосомного материала и описан генетический портрет предопухолевых состояний эпителия желудка. Будет установлен вклад различных аномалий хромосом в процессы инициации и прогрессии рака желудка. Реализация данного проекта позволит провести поиск возможных генетических маркеров для однозначной интерпретации латентной онкогенной трансформации клеток для ранней диагностики рака желудка. Кроме того, выполнение данного исследования позволит получить новые данные в области механизмов канцерогенеза желудка, клеточной и молекулярной биологии, онкогенетики и медицинской генетики.
1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

1.1 НЕКОТОРЫЕ ЭТИОЛОГИЧЕСКИЕ, ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАКА ЖЕЛУДКА

На сегодняшний день большой научно-практический интерес представляют исследования рака желудка, который, несмотря на снижение заболеваемости, остается одной из наиболее распространенных неоплазий в мире. Наиболее высокие показатели заболеваемости и смертности отмечены в Японии, Китае, Скандинавии и европейских странах, низкие – в США, Австралии, Канаде. По данным последнего обзора «Gastrointestinal cancers in Europe», ежегодно в Европе диагностируется около 2 000 000 новых случаев рака желудка, которые ответственны почти за 150 000 случаев смертей в год (Gastrointestinal cancers in Europe, 2003).

Данный тип неоплазии, как причина смертности населения России, занимает четвертое место (8,8%) после рака легкого (12%), молочной железы (11,9%) и рака кожи (10,6%). В структуре онкологической заболеваемости среди мужчин опухоли желудка занимают третье место (10,8%), среди женщин – второе (7,1%). Ежегодно в России регистрируется более 50 тыс. новых случаев опухолей данной локализации [1].

Патогенез рака желудка является примером генносредового взаимодействия. Некоторые эпидемиологические исследования показывают, что факторами риска развития рака желудка являются атрофия слизистой желудка, связанная с инфекцией Helicobacter pylori, курение, алкоголь, соленая пища, недостаточное употребление в пищу овощных продуктов [26, 33]. Таким образом, географические различия в частоте встречаемости данной патологии могут быть связаны как с генетическими, так и со средовыми факторами.

Опухоли желудка отличаются сложностью в диагностировании по причине отсутствия клинических проявлений на ранних стадиях и большим спектром генетических изменений. Канцерогенез желудка представляет собой сложный многоступенчатый процесс малигнизации клеток, в основе которого лежит множество генетических и эпигенетических факторов. В структуру геномных нарушений клеток рака желудка входит потеря гетерозиготности в специфических хромосомных регионах [36], микросателлитная нестабильность [32], мутации в онкогенах и опухолесупрессорах [27, 35] и эпигенетические модификации хроматина [37, 9].

Одной из характеристик малигнизированных клеток являются также хромосомные аберрации. Данный тип нарушения хромосомного материала клетки является одним из признаков канцерогенеза и возможно связан с активацией онкогенов и инактивацией опухолесупрессорных генов. Однако, несмотря на то, что на сегодняшний день обнаружено большое количество хромосомных нарушений в опухолевых клетках желудка, существуют разногласия во взглядах на роль определенных хромосомных аномалий в процессах инициации и прогрессии рака желудка.

В большинстве случаев рак желудка развивается на фоне длительно существующих предопухолевых изменений слизистой. Предраковые изменения представляют собой морфологические повреждения эпителия и замещение нормальной слизистой на диспластическую. Однако в желудке выявляются также различные морфологические заболевания неонкогенной природы, такие как хронический атрофический гиперпластический гастрит, аденоматозные полипы, пернициозная анемия, состояния после резекции желудка, болезнь Менетрие. Такие «фоновые» патологии могут способствовать появлению очага опухолевой инициации. Пациентов с такими заболеваниями включают в группы риска, ставят на диспансерный учет. Однако при этом, никакой превентивной предопухолевой терапии не проводится из-за отсутствия диагностических маркеров опухолевой трансформации для клинической диагностики предраковых заболеваний.

Кроме морфологических изменений предраковые заболевания характеризуются нарушениями хромосомного материала. Исследования хромосомных нарушений в клетках предраковых заболеваниях желудка, являющихся фактором риска развития опухоли, представляют большой научно-практический интерес, в связи с необходимостью более глубокого понимания процессов канцерогенеза желудка и, в последствие, адекватного выбора терапии для конкретного пациента.

Работы по изучению хромосомных аномалий хромосом в диспластических и непосредственно раковых клетках желудка проводятся с использованием различных методик и модельных объектов. Исследования с помощью стандартной цитогенетики сфокусированы в основном на изучении происхождения повторяющихся хромосомных нарушений. Однако эти исследования имеют ряд ограничений, связанных, прежде всего, со сложностью получения качественных препаратов метафазных хромосом, комплексной структурой нарушений, возможностью клональной селекции клеток с хромосомными аномалиями в условиях культивирования in vitro. Молекулярно-цитогенетические методы позволяют решать подобные проблемы путем исследования ДНК, выделенной непосредственно из опухолевой ткани, без приготовления препаратов хромосом. С развитием методов флуоресцентной гибридизации (fluorescence in situ hybridization, FISH) и сравнительной геномной гибридизация (comparative genomic hybridization, CGH) была получена важная информация о разнообразии нарушений хромосомного материала, вовлеченных в канцерогенез рака желудка.


1.2 ХРОМОСОМНЫЕ НАРУШЕНИЯ В КЛЕТКАХ ЛИНИЙ РАКА ЖЕЛУДКА

Первые исследования хромосомных аномалий при раке желудка были проведены на линиях опухолевых клеток с помощью методов стандартной цитогенетики в начале 60-х годов прошлого столетия. Первая линия (CaVe) была получена в 1963 году Добрыниным [23]. С того времени создано более 70 стабильных клеточных линий рака желудка, большинство из которых получили японские ученые. Наиболее широко используемыми являются линии серии MKN (MKN-1, MKN-7, MKN-28, MKN-45 и MKN-74), KATO-III и TMK-1, а также линии серии SNU, полученные Корейскими учеными в 1997 году. Клетки для культивирования данных линий были взяты от опухолей желудка человека различных гистологических типов, включая интестинальный и диффузный типы рака. В области молекулярной генетики рака линии MKN-7 и KATO-III занимают особое место, поскольку именно из них были впервые клонированы гены erbB-2 и K-sam [23].

Одной из первых методик для анализа хромосомных нарушений в опухолевых клетках явилось стандартное G-окрашивание метафазных хромосом. С его помощью в клетках линии SNU были выявлены аномалии 17 хромосомы, в частности делеция p плеча и частичная дупликация q плеча [10]. Наиболее частой аномалией была амплификация хромосомы 7 с точками разрыва в 7q22 и 7q31 участках. Хромосомные перестройки были также обнаружены в 1q32, 5q11-q22, 8q, 14q22, 14q34 и 15q15 участках [10]. Исследования на других линиях показали большое количество числовых и структурных хромосомных аберраций, включая перестройки хромосом 3, 11, делецию 6q21, трисомию по хромосоме 8, моносомию и транслокации по хромосоме 13 [28, 31]. Работы более поздних лет с применением методов стандартной цитогенетики также выявили структурные аберрации хромосом 7, 8, 14 и 17. Однако были обнаружены аномалии, затрагивающие и хромосомы 1, 6, 11 и 13. Кроме того, была выявлена амплификация 11p15 и транслокации t(1;7), t(7;14), t(6;17), t(5;14) [37].

Таким образом, с помощью методов классической цитогенетики впервые были охарактеризованы некоторые хромосомные нарушения в линиях опухолевых клеток рака желудка. Однако следует констатировать, что исследований хромосомных аномалий опухолевых клеток с применением методов стандартной цитогенетики было проведено сравнительно мало, что обусловлено, в первую очередь, отмеченными выше ограничениями метода. Это обстоятельство во многом затрудняло получение данных о структуре хромосомной изменчивости при раке желудка.

Появление технологий молекулярной цитогенетики позволило преодолеть ограничения классических методов цитогенетического анализа. С развитием метода флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), предложенного Пинкелем с соавторами в 1986 году [30], и его модификаций, появилась возможность выявления тонких структурных перестроек и стабильных хромосомных аберраций, которые невозможно было точно охарактеризовать методами рутинного или дифференциального окрашивания хромосом.

В 2004 году была получена новая линия рака желудка ACP01 [22]. Ее основой явились клетки аденокарциномы желудка интестинального типа. В нескольких исследованиях хромосомных нарушений на интерфазных клетках линии ACP01 с помощью FISH техники была обнаружена анеуплоидия по 8 хромосоме [22, 13].

Сегодня работы на линиях проводятся в основном с применением метода спектрального кариотипирования (spectral kyryotyping, SKY). Суть метода состоит в окрашивании хромосом набором флуоресцентных красителей, связывающихся со специфическими областями хромосом. В результате такого окрашивания гомологичные пары хромосом приобретают идентичные спектральные характеристики, что не только существенно облегчает выявление таких пар, но и облегчает обнаружение межхромосомных транслокаций, поскольку транслоцированные участки имеют спектр, отличающийся от спектра остальной хромосомы. Данная методика позволяет уточнить природу хромосомной аномалии. Также SKY применяется для выявления происхождения «маркерных хромосом» в геноме. Спектральное кариотипирование позволяет более детально описать аномальный кариотип опухолевой клетки [5].

Исследования линий рака желудка, проведенные с использованием SKY, выявили наличие большого количества транслокаций. Хромосомы 8 и 11 оказались наиболее часто вовлеченными в перестройки. Затем по числу аномалий следовали хромосомы 1, 7, 13, 17, 20. Наибольшая частота разрывов локализована в 8q24.1 участке, далее следовали регионы 11q13, 13q14, 20q11.2, 7q32, 17q11.2, 18q21, 17q23, 18q11.2 [40].

Таким образом, совершенствование методов исследований привело к накоплению определенного багажа знаний о структуре нарушений хромосомного материала в малигнизированных клетках. Появились представления о типах генетических аномалий и их ассоциации с определенными фенотипическими проявлениями неоплазий. Однако появление методов полногеномного анализа хромосомных аберраций в опухолевых клетках позволило встать на новую ступень в исследовании данной патологии и получить принципиально новые данные, позволяющие сделать большой шаг к разработке новых программ диагностики, терапии и лечения рака желудка.


следующая страница >>
Смотрите также:
Отчет о выполнении 1 этапа Государственного контракта № П1706 от 23 сентября 2009 г
345.83kb.
3 стр.
Отчет в 4 томах по исполнению I этапа Государственного контракта №07. Р20. 11. 0029 от 7 сентября 2011 г. Том 1
5561.57kb.
25 стр.
Отчету о выполнении 5 этапа Государственного контракта №14. В27. 21. 0467 от 06 августа 2012 по нир «Методика испытания многоцелевых обрабатывающих центров для проведения высокоскоростной обработки»
63.56kb.
1 стр.
Отчет о выполнении работ по шестому этапу государственного контракта №02. 740. 11. 0593 от «22» марта 2010 года на выполнение научно-исследовательских работ в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной
1463.34kb.
7 стр.
Отчет по исполнению I этапа Государственного контракта №07. P20. 11. 0060 от 19 октября 2011 г.
499.89kb.
4 стр.
Отчет о научно-исследовательской работе по исполнению Государственного контракта №900-01-41/06-12 от 23 мая 2012 г по теме
4553.39kb.
25 стр.
Отчет о научно-исследовательской работе по исполнению Государственного контракта №900-01-41/06-12 от 23 мая 2012 г по теме
3371.97kb.
23 стр.
Вопрос: Чем надлежит руководствоваться
38kb.
1 стр.
Отчет о выполнении государственного задания
124.92kb.
1 стр.
Отчет о выполнении мероприятий школьного этапа Соревнований классов «Наше здоровье- в наших руках»
20.54kb.
1 стр.
Отчету о выполнении 2 этапа
42.5kb.
1 стр.
Закон Ростовской области от 12 июля 2011 г. N 623-зс "Об утверждении отчета о выполнении Прогнозного плана (программы) приватизации государственного имущества Ростовской области за 2010 год"
80.31kb.
1 стр.