Главная
страница 1страница 2страница 3
1.3 ИССЛЕДОВАНИЯ ХРОМОСОМНЫХ НАРУШЕНИЙ ПРИ РАКЕ ЖЕЛУДКА С ПОМОЩЬЮ СРАВНИТЕЛЬНОЙ ГЕНОМНОЙ

ГИБРИДИЗАЦИИ

В настоящее время в исследованиях опухолевых тканей широкое распространение получил метод сравнительной геномной гибридизации (Comparative genomic hybridization, CGH), предложенный Анне Каллиониеми с соавторами в 1992 году [15]. Метод основан на гибридизации эквимолярных количеств тестируемой и контрольной ДНК с ДНК метафазных хромосом, полученных от здорового индивида. Тестируемая (опухолевая) и контрольная ДНК метятся различными флуорохромами. Мечение осуществляется, как правило, в реакции ник-трансляции, в ходе которой в последовательность ДНК включаются дезоксирибонуклеотиды, к которым прикреплены либо непосредственно флуорохромы (например, Fluorescein, Tamra), либо гаптены – репортерные молекулы (биотин, дигоксигенин), с которыми впоследствии в реакции иммунохимического окрашивания связываются антитела, имеющие в своем составе флуорохромные группировки. Далее с помощью специального программного обеспечения рассчитывается отношение интенсивности свечения флуорохромов вдоль каждой хромосомы набора. Полученное флуоресцентное отношение показывает содержание последовательностей ДНК в исследуемом образце по сравнению с эуплоидным контролем. При отсутствии хромосомного дисбаланса между тестируемой и контрольной ДНК отношение флуоресцентного свечения одного флуорохрома к другому (как правило, зеленого – маркирующего тестируемый образец, к красному – маркирующему контрольную ДНК) будет равно единице. В случае амплификаций хромосомного материала будет регистрироваться увеличение флуоресцентного отношения и его сдвиг в зеленую область спектра. При делециях флуоресцентное отношение, напротив, будет равно 0.

Основным достоинством CGH является детальное исследование числовых и несбалансированных структурных хромосомных нарушений в рамках одного эксперимента, исключающее необходимость приготовления цитогенетических препаратов из опухолевых клеток. Применение данной методики расширило знания о спектре и уровне хромосомных перестроек в опухолях различных локализаций, позволило идентифицировать тонкие аномалии хромосом и привело к быстрому накоплению знаний о роли хромосомных аберраций в возникновении и прогрессии рака.

На момент написания настоящего аналитического обзора по данным базы «Progenetix» с помощью CGH было проанализировано 979 образцов опухолевых тканей желудка. Наиболее общими нарушениями хромосомного материала в опухолевых клетках желудка являются амплификации 8q, 20q, 13q, 3q, 7q и 17q, а также уменьшение числа копий ДНК в 17p, 19p, 18q, 1p и 5q [2].

Рак желудка характеризуется различными клинико-морфологическими параметрами, такими как гистологический тип, венозное и лимфогенное метастазирование, тип предракового заболевания, в основе проявления которых лежат определенные хромосомные аберрации, эпигенетические, генетические и молекулярные события. Однако в соответствии с целью настоящего обзора рассмотрим ассоциацию именно хромосомных нарушений с некоторыми фенотипическими проявлениями данных характеристик. Большинство проведенных исследований были направлены на поиск специфических «повторяющихся» перестроек, сопоставление которых с генами, экспрессия которых изменилась в ходе возникновения этих перестроек, а также со степенью прогрессии опухоли, локализацией и гистологией, можно было бы использовать при выборе адекватных способов ранней диагностики и терапии опухоли. На сегодняшний день с помощью молекулярно-цитогенетического анализа описано множество хромосомных нарушений, ассоциированных с патологической картиной, стадией прогрессии опухоли, прогнозом заболевания. Кроме того, возможность исследования нативных и архивных образцов тканей данной патологии с известным патоморфологическим диагнозом, схемой химеолучевого лечения и результатом течения заболевания позволила получить новую ценную информацию по этим вопросам.

Некоторые исследования показали ассоциацию изменений числа копий ДНК с характером метастазирования. Так установлена связь между потерей хромосомного материала в 4q и 21q и лимфогенным метастазированием, амплификацией в 7р и делециями в 4q и 18q с венозной инвазией, а также потерей хромосомного материала в 18q со стадией патологического процесса [20].

Опухоли желудка отличаются высокой гетерогенностью по гистологическим подтипам. В соответствии с классификацией Лоурена выделяют два основных гистологических типа рака желудка: интестинальный и диффузный [21]. Развитие интестинального типа опухоли происходит ступенчато, через предраковые состояния. Изначальным патологическим изменением является атрофический гастрит, затем интестинальная метаплазия, дисплазия и карцинома. Диффузный тип рака желудка, напротив, не характеризуется ступенчатым развитием. В основе его возникновения лежит хронический гастрит, ассоциированный с инфекцией Helicobacter pylori [33].

Данные о связи хромосомных нарушений с гистологическим типом опухоли противоречивы. В некоторых работах показано отсутствие корреляций между специфическими хромосомными изменениями и гистотипом опухоли [4], тогда как в других работах публикуются данные о наличии подобных ассоциаций [17]. Так, по данным японской исследовательской группы, общим нарушением хромосомного материала в опухолях желудка интестинального типа является потеря генетического материала в 8p плече, в то время как амплификация хромосомного материала 8p плеча характерна для диффузного типа опухолей. Наиболее частыми нарушениями для интестинального типа являются также амплификации 20q и 9p районов. Амплификация 12q плеча является более общим нарушением в опухолях желудка диффузного типа [18]. В другом исследовании были описаны амплификации 18q и 20q, как аномалии характерные для интестинального типа рака, в то время как амплификации в 8q, 13q и 17q участках были основными для диффузного типа [19]. В исследовании 53 образцов опухоли желудка было показано, что аномалии 8q, 17q, 3p и 5q более часто выявляются в интестинальных опухолях желудка, а аномалии хромосомы 13, в частности амплификация 13q характерна для опухолей диффузного типа [24]. С другой стороны, в некоторых исследованиях не обнаружено корреляций между спектром хромосомных аномалий и гистологическим типом опухоли [25].

Выявленные в ходе исследований общие аномалии хромосомы 8 в двух различных гистологических типах рака желудка могут быть объяснены с локализацией на данной хромосоме онкогена C-MYC, аномальная экспрессия которого регистрируется в широком спектре опухолей. Амплификации в 20q также обнаружены при многих типах рака, в частности, при раке груди и раке прямой кишки. Амплификации 17q плеча часто детектируются в различных неоплазиях человека, таких как рак гортани и рак легкого.

Наблюдаемые различия в типах хромосомных нарушений, характерных для двух гистотипов опухолей желудка, возникают, предположительно, вследствие разных генетических путей патогенеза данных гистотипов рака и, соответственно, вовлечения специфических аномалий хромосом. Интересно, что наличие корреляций между хромосомными нарушениями и гистологическим типом неоплазии желудка показано в основном для так называемых популяций высокого риска заболеваемости, таких как Япония и Корея. Таким образом, отсутствие подобных ассоциаций в некоторых работах можно объяснить некоторыми популяционными особенностями, определяющими, возможно, другую генетическую модель канцерогенеза желудка.

Эти данные показывают, что нарушения хромосомного материала могут играть важную роль в канцерогенезе различных гистологических подтипах желудка и применяться как прогностические и диагностические маркеры в клинической практике.

В большинстве случаев рак желудка развивается на фоне длительно существующих предопухолевых изменений слизистой. Предраковые изменения представляют собой морфологические повреждения эпителия и замещение нормальной слизистой на диспластическую.

Исследования хромосомных нарушений в предраковых заболеваниях желудка представляют большой научно-практический интерес, в связи с необходимостью поиска генетических маркеров для ранней диагностики заболевания, а также для более глубокого понимания генетических механизмов инициации процессов канцерогенеза и, впоследствии, адекватного выбора терапии для конкретного пациента. Работ, посвященных данной проблеме на сегодняшний день не очень много, что объясняется диагностикой рака желудка уже на поздних стадиях развития, в связи с отсутствием ранних клинических проявлений у пациентов.

В ходе проведенного сравнительного анализа хромосомных нарушений в образцах аденомы и карциномы желудка, было показано, что общий уровень хромосомных аберраций в клетках аденомы был ниже, чем уровень нарушений в клетках аденокарциномы желудка [25]. Кроме того, спектр аномалий был также различен. Наиболее общим нарушением хромосомного материала в клетках аденоматозной ткани была потеря хромосомного материала в 16p и 17p участках. Тогда как основными аномалиями в клетках аденокарциномы являлись амплификации 8q, 13q, 20p и потери хромосомного материала в 12q, 14q, 15q, 16p и 17р.

В другом исследовании была обнаружена амплификация короткого и длинного плеч хромосомы 17 и 20q и потеря хромосомного материала в 4q, 5q и 6q аденомы пилорической железы. В то время как основными аномалиями в клетках высокодифференцированной аденокарциномы были амплификации 1p36-pter, 9q34-qter, 17q24-qter, 20pq и 22q и потери хромосомного материала в 6q и 18q. Кроме того, с высокой частотой выявлялась амплификация участка 15q26 [20].

Данные работы показывают наличие большего спектра хромосомных аберраций в клетках опухолевых тканей желудка по сравнению с клетками тканей предраковых состояний желудка. Различия в уровне и спектре аномалий в клетках предраковых заболеваниями и опухолевых клетках желудка свидетельствуют об аккумулировании в ходе канцерогенеза хромосомных нарушений, что по видимому, способствует развитию опухоли и отбору клеточных клонов с определенными типами хромосомных нарушений.

Несомненно, что исследования нарушений хромосомного материала у пациентов разных возрастных категорий имеют важное научно-практическое значение для более глубокого понимания механизмов канцерогенеза, определения программ развития опухоли, идентификации специфических маркеров опухолевого процесса в отношении возрастного критерия пациентов.

Усовершенствование метода CGH основано на использовании вместо препаратов метафазных хромосом искусственно сконструированной матрицы, состоящей из прикрепленных к подложке клонированных районов генома. Данная модификация метода получила название матричной CGH (array-CGH).
1.4 НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ИССЛЕДОВАНИЯ ХРОМОСОМНЫХ НАРУШЕНИЙ ПРИ РАКЕ ЖЕЛУДКА

В основе метода array-CGH лежат основные принципы классической CGH с использованием окрашенной разными флуоресцентными красителями тестируемой и контрольной ДНК. Анализируемая и контрольная ДНК гибридизуются с фрагментами клонированной ДНК, помещенной на стекло (ДНК-платформа). Изменение в числе копий ДНК определяется по разнице в интенсивности свечения тестовой и контрольной ДНК. Стоит отметить, что чувствительность и специфичность array-CGH анализа практически полностью зависят от типа ДНК-платформы, а именно от количества клонов в матрице и вида клональной амплификации. На сегодняшний день большинство данных array-CGH анализа получены с использованием BAC (Bacterial Artificial Chromosome) клонов, которые обеспечивают достаточную интенсивность сигналов для детекции однокопийных изменений. Современные BAC-платформы варьируют по плотности от 2400 до 30000 клонов на биочип. Размер данных клонов колеблется в пределах от 150 до 200 kb.

Другой подход связан с конструированием олигонуклеотидных платформ. Данные платформы характеризуются одноцепочечными олигонуклеотидными элементами протяженностью от 25 до 85 нуклеотидов. Изначально подобные платформы были изготовлены для определения олигонуклеотидных полиморфизмов, однако затем они стали использоваться для высокоразрешающего анализа числа копий ДНК. Платформы конструируются в зависимости от целей исследования. Например, одноканальная платформа фирмы Affymetrix (Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0) характеризуется возможностью анализа 1800000 генетических маркеров, включая 906.600 однонуклеотидных полиморфизмов и 946000 проб для детекции изменений числа копий ДНК [3]

Таким образом, разрешающие способности метода array-CGH ограничивается только размерами клонов ДНК. Следовательно, можно сконструировать микрочип, покрывающий интересующий хромосомный регион с необходимой плотностью.

Array-CGH широко используется в исследованиях опухолей человека. Основной областью применения данного метода является идентификация диагностических и прогностических генетических маркеров, маркеров опухолевой прогрессии, полногеномный скрининг числа копий ДНК.

Использование данного подхода в исследованиях процесса канцерогенеза желудка позволило обнаружить более тонкие, ранее не детектированные, аномалии хромосом в малигнизированных клетках, связанные с различными параметрами опухолевого процесса, а также клинико-морфологическими характеристиками неоплазий.

Одним из направлений исследований рака желудка с помощью данного метода является ассоциация изменения числа копий ДНК с фенотипическими и морфофункциональными характеристиками данного типа опухоли, что является важным при разработке стратегии лечения.

Так, была обнаружена корреляция амплификации 1q32.3 и 18q22 хромосом с более агрессивным ростом опухоли и плохим клиническим прогнозом [28]. В исследовании 28 аденокарцином желудка была выявлена корреляция между амплификацией некоторых районов хромосом и клиническим статусом неоплазии. Также было показано, что потери хромосомного материала в 9p23 и 14q31 ассоциированы со статусом лимфатических узлов, а потери хромосомного материала в 4q23 и 4q28 связаны с метастазированием. [16]. В другом исследовании была выявлена связь между потерей хромосомного материала в 3p13 участке и перитонеальным метастазированием [39]. Таким образом, обнаруженные ассоциации нарушений хромосомного материала с биологическими параметрами опухоли потенциально могут быть использованы в клинике для характеристики опухолевого роста с последующим составлением индивидуальной схемы терапии опухоли. Кроме того, данные о потере хромосомного материала в определенных регионах могут использоваться в оценке метастатического потенциала опухоли желудка, что является важным аспектом при выборе объема оперативного вмешательства.

В области исследований канцерогенеза желудка проводятся работы с использованием array-CGH по картированию кандидатных генов, которые могут играть важную роль в процессах развития опухоли.

Так, по данным недавних исследований были обнаружены амплификации 16q21, 19q13.1, 5p15.1 и 3q26.31 участков и потери хромосомного материала в 3p21.32, 3p22.2, 19q13.33 и 19p13.3 участках. Наиболее частой аномалией оказалась потеря хромосомного материала в 19p13.3. Дальнейшее исследование одного из кандидатных опухолесупрессорных генов ZIPK (ZIP kinase), локализованного в 19p13.3 районе с помощью иммуногистохимических методов и применения тканевого биочипа, содержащего 172 первичные опухоли желудка, показало снижение экспрессии данного гена в 64,5% случаев, что значимо было связано с инвазией, метастазированием и плохим прогнозом [6]. Таким образом, анализ опухолесуппрессорного гена ZIPK может быть использован при оценке выживаемости, глубины инвазии и характере метастазирования опухоли желудка.

Начальный этап развития неоплазии желудка характеризуется определенными изменениями эпителия, а именно очаговой пролиферацией клеток. Данное состояние эпителия характерно для предраковых заболеваний желудка. Пролифераты из молодых мономорфных клеток и пролифераты из молодых клеток с наличием среди них анаплазированных, недифференцированных клеток характерны для факультативного и облигатного предраков соответственно.

Исследования диспластических изменений в тканях желудка на ранних стадиях процесса малигнизации и предраковых заболеваний желудка, направлены на поиск маркеров для ранней диагностики заболевания, а также способствуют углублению знаний о процессах малигнизации клеток и канцерогенеза желудка. В ходе исследования клеток тканей аденомы желудка c помощью BAC-платформ было обнаружено, что увеличение числа копий ДНК в 20q13.12-q13.33, 11q23.2, 9q33.1-q34.3 районах, трисомия по хромосоме 20, а также потеря числа копий ДНК в 6q10-q22.1, 6p21.1-q16.3, 13q21.2-21.33, 5q22.1-q23.2 и моносомия по хромосоме 10 являются основными хромосомными нарушениями в клетках тканей предраковых заболеваний желудка [8].

Были проведены работы по сравнению хромосомных нарушений в тканях ранних и поздних стадий рака желудка. Увеличение числа копий 8q23-24.1 региона и уменьшение числа копий в 17р плече были общими в двух группах сравниваемых группах опухолей, тогда как амплификации 8p22-23, 1q25-31 были характерны для опухолей ранних стадий. Для неоплазий поздних стадий развития был типичен более широкий спектр хромосомных нарушений, в который входили увеличение числа копий в 7р, 11q, 2q и 15q26, уменьшение числа копий в 17q, 21q, 3p и 18q [29].

Array-CGH используется и в экспериментах на клеточных линиях. Исследование 31 клеточной линии рака желудка с использованием 800 BAC клонов, содержащих последовательности генов, потенциально играющих важную роль в канцерогенезе желудка, показало увеличение числа копий в 8q24.21, 20q13.13, 20q13.2, 20q11.21, 20q11.23, Xq28, 11q13.4, 7q21.2 и уменьшение числа копий ДНК в 9q21.3, 9q24.1, 18q21.1, 18q21.2, 18q23 районах. В данной работе была обнаружена амплификация гена CDK6, локализованного в 7q21.2 регионе. Нарушения в работе данного гена при раке желудка ранее никогда не были детектированы. Ядерная экспрессия CDK6 характерна для ранних стадий рака желудка, что может оказаться диагностическим фактором при раке желудка [34].

Благодаря высокой специфичности, чувствительности и быстроте обработки данных, array-CGH позволяет оптимизировать и ускорить процесс диагностики рака, что важно для клинической практики. Использование ДНК-клонов позволяет практически неограниченно расширить исследования специфических генов, связанных с канцерогенезом рака желудка. С появлением данной методики стало возможным намного более детальное исследование генома опухолевых клеток. Накопление и систематизация знаний о хромосомных нарушениях в опухолевых клетках рака желудка позволят выбирать наиболее адекватные и действенные методы терапии опухолей, диагностировать малигнизацию клеток на ранних стадиях процесса, еще до проявления клинических признаков.

Развитие и прогрессия рака желудка происходит вследствие аккумуляции хромосомных, генетических и эпигенетических аберраций. С развитием новых молекулярно-генетических технологий нарушения хромосомного материала, генная дерегуляция и другие цитогенетические изменения могут быть детально исследованы в тканях рака желудка. Молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе канцерогенеза желудка, включают активацию онкогенов, снижение регуляции опухолесупрессорных генов, нарушения функционирования генов-регуляторов клеточного цикла, молекул клеточной адгезии и генов репарации ДНК.

Однако именно хромосомные аберрации являются одной из основных характеристик рака желудка. Таким образом, потеря или амплификация хромосомного материала является одним их механизмов развития рака желудка, поскольку следствиями данных нарушений могут быть изменения в дозе генов, являющихся критичными для канцерогенеза данного органа. Изменение в экспрессии генов, приводит к аномальным событиям в клетке и нарушает ее нормальнее функционирование. Хромосомные нарушения и, как следствие, аномальная работа генов, участвующих в развитии рака желудка связаны с различными клиникоморфологическими параметрами опухоли и идентификация подобных генов имеет важное значение в диагностике, прогнозе заболевания и терапии.

Процесс канцерогенеза характеризуется аккумуляцией определенных хромосомных нарушений в малигнизированных клетках. Развитие опухоли характеризуется накоплением хромосомных аберраций, которые определяют такие свойства неоплазии как агрессивный рост, неопластический ангиогенез, метастазирование и устойчивость к защитным системам организма.

Предраковые заболевания желудка являются первой начальной стадией развития опухолевого процесса. Таким образом, получение общей картины нарушений хромосомного материала в клетках данных патологических состояний с диспластическими изменениями будет способствовать накоплению новых знаний о канцерогенных процессах на ранних стадиях развития неоплазии желудка до клинических проявлений опухоли. Кроме того, сравнение уровня и спектра хромосомных аберраций в клетках предраковых заболеваний желудка и зрелых опухолей, возможно, откроет механизмы клонального отбора диспластических клеток с определенным генетическим портретом, обеспечивающим быстрый рост и развитие опухоли, что определит выбор необходимой предопухолевой терапии для своевременного воздействия на морфологически измененные ткани эпителия желудка. Решение этих вопросов является актуальным направлением исследований в области изучения цитогенетики как злокачественных новообразований в целом, так и рака желудка в частности.
2. ВЫБОР ОБОСНОВАННОГО ВАРИАНТА НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

В связи с вышеприведенными фактами анализа научно-практической литературы представляется актуальным вариант научно-исследовательской работы по проблеме канцерогенеза желудка, касающийся полногеномного профилирования хромосомных нарушений в тканях эпителия желудка на ранних стадиях трансформации и в клетках тканей предраковых заболеваний данного органа. Как уже было описано выше, предрак является начальным изменением эпителия желудка и определение спектра и структуры хромосомных аберраций на данном этапе онкогенной трансформации позволит более глубоко понять механизмы канцерогенеза желудка.

Выбор для исследования биопсийного и операционного материала позволит анализировать ДНК, выделенную непосредственно из диспластических тканей. Данный подход обеспечит детекцию хромосомных нарушений, непосредственно в тканях с предраковыми заболеваниями желудка и позволит избежать ложноположительных результатов, как это возможно в случае работы с клеточными линиями. Формирование выборок на данном этапе работы, а также составление базы данных пациентов с гистологически подтвержденным диагнозом, позволяет структурировать материал и обеспечить чистоту эксперимента и исследовать образцы с уже известным исходом заболевания.

Метод фенольной экстракции, выбранный для выделения ДНК на первом этапе научно-исследовательской работы, является стандартной методикой, позволяющей получить достаточное количество необходимого материала высокой степени чистоты, что является критичным для проведения дальнейших исследований.

С помощью методики ник-трансляции на основе выделенной ДНК из предраковых тканей и ДНК из крови здорового индивида (контрольная ДНК) будут получены будут синтезированы полногеномные зонды, меченные различными флуорохромами. Данные зонды необходимы для проведения дальнейшей сравнительной геномной гибридизации и получения полногеномных профилей тканей с предраковыми изменениями желудка.

В ходе дальнейшего выполнения работы с помощью современной молекулярно-цитогенетической методики CGH будут определены профили хромосомных нарушений в диспластических тканях желудка. CGH обеспечивает детальной исследование всех структурных и числовых нарушений хромосомного материала в одном эксперименте, полностью исключая этап приготовления препаратов метафазных хромосом из исследуемой ткани. Использование данной методики является широко применяемым подходом во многих молекулярно-генетических лабораториях, является оптимальным подходом для проведения данной работы и полностью соответствуя задачам исследования.


3. ПЛАН ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

И ТЕОРИТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

На первом этапе проведения научно-исследовательской работы планируется провести аналитический обзор научно-практической литературы по вопросу исследований молекулярно-генетических, клинико-морфологических, эпидемиологических характеристик опухолей и предраковых состояний желудка. Изучить базы данных по хромосомным нарушениям при раке желудка, полученные с помощью CGH и других молекулярно-цитогенетических методик. Кроме того, необходимо провести набор материала и сформировать выборки биопсийного и операционного материала тканей эпителия желудка с предраковыми заболеваниями, ранними стадиями рака желудка, а также сбор анамнеза пациентов и оформление базы данных с гистологически подтвержденным диагнозом, что является критичным при анализе полученных результатов полногеномного профилирования. Также планируется провести выделение ДНК из биопсийного и операционного материала тканей эпителия желудка методом фенольной экстракции, выбранных для выполнения цели работы. После выполнения всех запланированных этапов первого года работы необходимо подготовить отчетную документацию по итогам работы.


<< предыдущая страница   следующая страница >>
Смотрите также:
Отчет о выполнении 1 этапа Государственного контракта № П1706 от 23 сентября 2009 г
345.83kb.
3 стр.
Отчет в 4 томах по исполнению I этапа Государственного контракта №07. Р20. 11. 0029 от 7 сентября 2011 г. Том 1
5561.57kb.
25 стр.
Отчету о выполнении 5 этапа Государственного контракта №14. В27. 21. 0467 от 06 августа 2012 по нир «Методика испытания многоцелевых обрабатывающих центров для проведения высокоскоростной обработки»
63.56kb.
1 стр.
Отчет о выполнении работ по шестому этапу государственного контракта №02. 740. 11. 0593 от «22» марта 2010 года на выполнение научно-исследовательских работ в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной
1463.34kb.
7 стр.
Отчет по исполнению I этапа Государственного контракта №07. P20. 11. 0060 от 19 октября 2011 г.
499.89kb.
4 стр.
Отчет о научно-исследовательской работе по исполнению Государственного контракта №900-01-41/06-12 от 23 мая 2012 г по теме
4553.39kb.
25 стр.
Отчет о научно-исследовательской работе по исполнению Государственного контракта №900-01-41/06-12 от 23 мая 2012 г по теме
3371.97kb.
23 стр.
Вопрос: Чем надлежит руководствоваться
38kb.
1 стр.
Отчет о выполнении государственного задания
124.92kb.
1 стр.
Отчет о выполнении мероприятий школьного этапа Соревнований классов «Наше здоровье- в наших руках»
20.54kb.
1 стр.
Отчету о выполнении 2 этапа
42.5kb.
1 стр.
Закон Ростовской области от 12 июля 2011 г. N 623-зс "Об утверждении отчета о выполнении Прогнозного плана (программы) приватизации государственного имущества Ростовской области за 2010 год"
80.31kb.
1 стр.