Главная
страница 1страница 2страница 3страница 4

Публикации результатов исследования. Основные положения и результаты отражены в 48 публикациях; из 40 статей 2 опубликованы в зарубежных журналах, 4 представлены главами в книгах, 16 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных научных результатов докторских диссертаций. По теме диссертации получено 6 патентов.


Связь работы с научной тематикой организации. Работа выполнена в рамках НИР ГНЦ РАМН (номера государственной регистрации НИР: 01200501366, 2005-2009 г.г. “Разработка новых средств для профилактики тромбозов и остановки кровотечений” и 01200001744, 2004-2005 г.г. “Разработка новых средств диагностики и лечения тромбозов и ДВС-синдрома”).

Личный вклад соискателя. Автор самостоятельно определяла направление исследований, осуществляла поиск перспективных, с точки зрения антикоагулянтной активности, органических соединений разной структуры и осуществляла контакты с предполагаемыми соавторами – химиками. А также, планировала ход экспериментов, самостоятельно получала результаты ко всем главам диссертации, анализировала результаты и формулировала выводы.

Апробация работы Основные результаты и положения предлагаемой работы за период с 1995 по 2004 г.г. были представлены на 20 Всесоюзных/Всероссийских и 12 Международных съездах, конгрессах, симпозиумах, конференциях; за последние 5 лет : 30, 33 Конгрессы Федерации Европейских биохимических обществ: Будапешт (2005), Афины (2008); Вторая Европейская школа по биореологии, Варна (Болгария), 2006; 14 Конференция Европейского общества по клинической гемореологии и микроциркуляции, Дрезден, 2007; II Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии, 2005, Москва; Первая международная научно-практическая конференция «Биологические и медицинские технологии: от научных результатов - к инновационным разработкам» 2005, Москва; Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины, 2005, Киров; Международная конференция "Гемореология в макро- и микроциркуляции", Ярославль, 2005; II Всероссийская конференция Всероссийской Ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудов им. А.А.Шмидта-Б.А.Кудряшова, Ярославль 2005; Вторая Международная научно – практическая конференция «Перспективы развития биотехнологий в России», Пущино (Московская область), 2005; Третья Международная Научно-практическая Конференция МЕДБИОТЕК «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине», Москва 2006; III съезд фармакологов России Фармакология –практическому здравоохранению, Санкт-Петербург, 2007; 3 Всероссийская конференция "Клиническая гемостазиология  и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", 2007, Москва; III съезд фармакологов России Фармакология –практическому здравоохранению, Санкт-Петербург, 2007; V Всероссийская конференция-школа «Химия и технология растительных веществ», Уфа 2008; "IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов" Новосибирск 2008; Всероссийская конференция с международным участием "Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению" Москва 2008; IV Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (с международным участием), Москва 2009; XII научно-практическая конференция “Химия – XXI век: новые технологии, новые продукты”, Кемерово, 2009; VII Всероссийская научная конференция “Химия и медицина” Орхимед-2009, Уфа; Конференция “Химическая биология – фундаментальные проблемы бионанотехнологии”, Новосибирск, 2009.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, глав обзора литературы, материалов и методов исследования, а также 7 глав собственных результатов, заключения, выводов, рекомендаций, списка литературы и приложения (450 страниц); число рисунков 123, таблиц 114. Список цитированной литературы включает 788 наименований, в том числе 62 работы на русском и 726 – на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение, анализ химического состава и структуры соединений для исследования антикоагулянтной активности проводили в следующих организациях: нефракционированные сульфаты хитозана (СХ) с ММ 20-123 кДа и степенью сульфатирования (СС) 0,62-1,86 исследовали на кафедре технологии химических волокон Московского государст­венного текстильного университета им. А.Н. Косыгина [Вихорева Г.А. и др., 1990]; низкомолекулярные СХ с ММ 1,6 – 40 кДа и содержанием серы 6,1 -16,8% исследовали на кафедре технологии химических волокон Московского государст­венного текстильного университета им. А.Н. Косыгина и в лаборатории инженерии ферментов Центра “Биоинженерия” РАН [Vichoreva G.A. и др. 2004; Банникова Г.Е и др. 2002]: химически модифицированные хитозаны, низкомолекулярные гепарины с ММ 1,6 – 9,0 кДа и хитозаны с ММ 4-21 кДа и степенью дезацетилирования 61-93 % - в лаборатории инженерии ферментов Центра “Биоинженерия” РАН [Ильина А.А. и др. 2007; Банникова Г.Е и др. 2002]. Выделение, изучение химического состава и структуры фукоиданов из бурых морских водорослей Охотского моря Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Laminaria japonica, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Costaria Costata, а также деполимеризацию фукоиданазой, десульфатирование, освобождение от белков и полифенолов проводили в лаборатории химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (Владивосток) [Kusaykin M. и др., 2008; Шевченко Н.М. и др., 2007; Zvyagintseva T.N. и др, 2005]. Ферментативное расщепление экстрактом из гепатопанкреаса камчатского краба фукоидана из водоросли Laminaria saccharina с целью получения фрагментов полисахарида с меньшей ММ, сульфатирование альгиновой кислоты из бурой водоросли Macrocystis purifera и создание наноструктур на основе сульфата альгиноовой кислоты осуществляли в лаборатории инженерии ферментов Центра “Биоинженерия” РАН [Ильина А.В. и др., 2009]; фракционирование фукоидана из водоросли Laminaria saccharina методом ионообменной хроматографии с целью получения фракций, обогащенных фукозой и сульфатными группами проводили в лаборатории химии гликоньюгатов Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН [Cumashi A. и др., 2007]. Сульфатированные низкомолекулярные галактоманнаны (СГМ) из семян Cyamopsis Tetragonoloba (L.) Taub. с ММ 12,6 – 245,6 кДа, гуаровую камедь из Cyamópsis tetragonólobus (L.) Taub., галеговую камедь Galega orientalis Lam, софоровую камедь из семян софоры японской (Styphnolobium japonicum), камедь Локуст бин (Locust Bean), полисахаридные ионные комплексы, компонентами которых служили галактозилированный хитозан, N-сукцинилхитозан и сульфатированный галактоманнан в разных весовых пропорциях (табл. 6.4.1. в приложении), карбоксиметилированные галактоманнаны с ММ 141 кДа и содержанием групп SO4-2 - 48,8 – 62,8 % и наноструктуры на основе ГМ из семян Cyamopsis Tetragonoloba (L.) Taub. полу­чали в лаборатории инженерии ферментов Центра “Биоинженерия” РАН и в лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН [Ильина А.В. и др., 2005,2006,2007; Местечкина Н.М. и др., 2008]. Выделение, изучение химического состава, структуры и химическое модифицирование целлюлозы и крахмала осуществляли в Институте химии Коми научного центра УрО РАН (Сыктывкар) [Торлопов М.А. и др., 2006,2007,2008]. Выделение, изучение химического состава, структуры и химическое модифицирование сульфатов пектина из травянистых растений осуществляли в отделе молекулярной иммунологии и биотехнологии Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар) [Оводов Ю.С. и др. 2008]. Сульфатированную целлюлозу из древесины пихты, осины, соломы пшеницы и цианидины из коры березы, ели, сосны, лиственницы, кедра получали в лаборатории каталитической химии угля и биомассы института химии и химической технологии СО РАН (Красноярск) и на кафедре органической химии Сибирского федерального университета (Красноярск) [Кузнецова С.А. и др. 2006, 2007, 2008,2009]. Фукозилированные олигосахариды синтезировали в лаборатории гликоконьюгатов Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН [Устюжанина Н. и др, 2007; Крылов В. и др. 2008,2009]. Производные пептидов: Z-Аla-Ala-Arg-Рip*ТFA; Z-Ala-Ala-Arg-Mf*HBr; Ac-Trp-Arg-Mf*HCl; Fta-Gly-Arg-Pip*ТФА; (Ac-Trp-Arg-Pip*ТФА синтезировали в лаборатории химии белка ГосНИИгенетика. Выделение, изучение химического состава и структуры экспериментального концентрата антитромбина человека осуществляли в лаборатории фракционирования белков плазмы ГНЦ РАМН [Ажигирова М.А. и др. 2006].

Выделение кофактора гепарина II (ГК) из плазмы крови человека осуществляли по [Sheehan J.P. и др., 1994]. Электрофоретический анализ ГК проводили в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия по [Tollefsen D.M., 1997].

Для получения плазмы человека, лишенной антитромбина (АТ) использовали метод [Hoogendoorn H. и др., 1980]. Нефракционированный гепарин (153 aIIa ЕД/мг) связывали с CNBr-активированной сефароза 4В (Pharmacia Fine Chemicals) по [Miller-Andresson M. и др. 1974].

Комплексы бычьего АТ с сульфатом хитозана (СХ, aIIa активность - 20 ЕД/мг) получали инкубацией растворов АТ ( Sigma, 5 мг/мл) и СХ (7,6 мг/мл) в молярном соотношении 1:1 в 0,01М трис-НCl буфере pH 7,4, содержащем 0,15М NaCl, в течение 15 мин при 20 ºС [Башков Г.В., 1987]. Содержание белка в комплексах определяли спектрофотометрически, принимая А1%280 (1 см) для АТ быка = 6,0 [Chuang Y.J. и др., 2001]. Концентрацию СХ определяли спектрофотометрически при длине волны 220 нм [Bernkop-Schnurch A., 2000] и по окрашиванию азуром [Mori T. и др., 1998].

Ракетный биоспецифичный электрофорез [Drozd N.N. и др., 2001] комплексов АК с поликатионами (сульфат протамина и хитозаны с ММ 4-21 кДа) проводили в слое 1% агарозы в 0,1М натрий фосфатном буфере рН 6,8. Пластины с высохшим гелем сканировали, переводили изображение в формат JPG и оценивали высоту и площадь пиков преципитации с помощью программы PhotoM 1,31.

Турбидиметрическое титрование [Мазов М.Ю. и др., 1983] антикоагулянтов (0,25 мг/мл) проводили сульфатом протамина (“Spark” или “Sigma”) и хитозанами с ММ 4-21 кДа (0,25 мг/мл).

Ингибирование фибриногенсвертывающей и амидолитической активности тромбина посредством антитромбина, кофактора гепарина II и образцов СХ: влияние СХ на каталитическую активность тромбина (Т) по отношению к фибриногену определяли по [Kiphuth I.C. и др., 2008]. Влияние АК на ингибирующую активность АТ по отношению к Т оценивали по [Machovich R. И др., 1986 и определяли константы псевдо-первого порядка ингибирования тромбина посредством АТ и ГК в присутствии АК. АТ выделяли по [Башков Г.В. и др. , 1989]. Константы ингибирования второго порядка взаимодействия АТ-Т рассчитывали (согласно модели [Griffith M.J., 1982]) по скорости ингибирования 1 нМ Т (Sigma) 10-тью нМ АТ (Sigma) в 0,1 М триэтаноламин-HCl буфере рН 7,8 содержащем 0,1 М NaCl и 0,1 % полиэтиленгликоль 6000 при 37 ºС в присутствии 0,2 мкМ хромогенного субстрата S 2238 [Scully M.F. и др., 1989].

Определение антикоагулянтной активности соединений in vitro: влияние АК на внутренний, внешний и общий пути свертывания крови оценивали используя общепринятые тесты - время свертывания крови (ВСК) [Lee R.I., 1913], время рекальцификации (ВР) [Kennedy C.C. и др., 1973], активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) [Stuart R.K. и др., 1971], протромбиновое время (ПВ) [Rosenberg R.D., 1977], тромбиновое время (ТВ) [Teien A.N., 1975], тромбин-Ca время (Т-Са) [Колмен Р.У., 1988]. Для определений применяли наборы отечественных (Ренам, Технология стандарт) и зарубежных (Sigma, Biopool, Roche) фирм. Специфическую АК активность образцов in vitro определяли по ингибированию фибриногенсвертывающей и амидолитической активностям тромбина (антитромбиновая, анти- фактор IIa, aIIa активность) [Coyne E., 1981; Teien A.N. и др. 1977] и фактора Ха (активность против фактора Ха, анти-фактор Ха, аХа активность) [Teien A.N. и др., 1976; Yin E.T. и др., 1973] в плазме человека или экспериментальных животных c использованием Международных стандартов НФГ или НМГ. Определение aIIa активности с использованием теста АЧТВ проводили по [Coyne E. И др., 1981], с использованием ингибирования амидолитической активности тромбина – по [Teien A.N. и др., 1977; Yin E.T. и др., 1973]. Определение аХа активности по ингибированию фибриногенсвертывающей активности фактора Ха проводили по [Yin E.T., 1973], по ингибированию амидолитической активности фактора Ха - по [Rezaie A.R. , 2006; Teien A.N. и др., 1976]. IC50 рассчитывали по [Motulsky H.J., 2003].

Нейтрализацию антикоагулянтной активности in vitro исследуемых СП поликатионами проводили в тестах по ингибированию фибриногенсвертывающей или амидолитической активностей тромбина и фактора Ха [Racanelli A. И др., 1989; Torjemanea L. И др., 2008].

Анализ ингибирования генерации тромбина (ГТ) проводили по [Sollier C.B. и др., 2004]. Под кривой ГТ находили площадь (AUC [Motulsky H.J., 2003]) и рассчитывали процент ингибирования: [AUC(ГТ) контроль – AUC(ГТ) с НМГ]/AUC(ГТ) контроль [Lormeau J.C.,1993].

Агрегацию тромбоцитов исследовали по [Born G.V., 1962]. Число тромбоцитов определяли по поглощению 0,4 мл богатой тромбоцитами плазмы кроликов или человека при = 800 нм [Walkowiak B. И др., 1989] и на счетчике форменных элементов фирмы “Coultronix” (Франция).

Антикоагулянтная активность образцов in vivo. Экспериментальные исследования выполнены на 327 кроликах Шиншилла обоего пола массой 2,5-4,5 кг и на 720 крысах-самцах Wistar массой 250-400 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая", находившихся на стандартной диете в боксированных помещениях с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes. Ctrasbourg, 1986). Разброс животных в группе по массе тела не превышал ± 10%. Животные контрольных и опытных групп одного пола, возраста, получены из питомника одновременно. Фармакологическую активность исследуемых образцов определяли при в/в или п/к введениях кроликам или крысам. Внутривенное введение АК кроликам осуществляли в краевую вену уха, крысам - в левую яремную вену; подкожное введение кроликам проводили в складку со стороны спины. В качестве отрицательного контроля использовали введение физиологического раствора. В качестве положительного контроля применяли растворы НФГ или фраксипарина. Кровь у кроликов отбирали методом капель из краевой вены противоположного уха, кровь у крыс забирали из противоположной яремной вены в пластиковую пробирку с 0,11 М раствором C6H5O7Na в соотношении 9:1. Для получения бедной тромбоцитами плазмы пробирки откручивали при 1400g 20 мин. Анти-IIa [Teien A.N., 1975] и aXa [Yin E.T. и др., 1973] активности плазмы крыс оценивали в разные интервалы времени после введения. Кровь для исследования отбирали до введения и через 5-300 мин после в/в введения или через 60, 120, 180, 240, 300 мин и 24, 48 час после п/к введения. Для расчета фармакокинетических параметров данные представляли в виде полулогарифмических графиков выведения исследуемого вещества с использованием затем электронного ресурса SummitPK.com.

Антитромбиновую активность образцов СХ в системе ex vivo рассчитывали на базе кривых выведения АК после в/в введения кроли­кам. В основу методики положено математическое описание действия НФГ, предложенное ранее [De Swart C. И др., 1982].

Активность плазминогена [Markwardt F., Klocking H.P., 1977] в плазме кроликов и крыс после введения антикоагулянтов определяли с использованием набора НПО “Ренам” Реахром-Плазминоген. Активность протеина С [Yang L. и др., 2002] в плазме кроликов и крыс после введения антикоагулянтов определяли с использованием набора НПО “Ренам” Реахром-Протеин-С.

Исследование антитромботической активности проводили на модели венозного стаза у крыс по [Wessler S. и др.,1959]. Эфективность антитромботической активности оценивали: 1. по форме тромба, извлеченного из перевязанного участка вены (в баллах); пересчет системы баллов на процент предотвращения тромбоза проводили по [Holmer E. и др., 1986]; 2. по весу влажного тромба на аналитических весах. 3. по концентрации белка в гомогенате тромба [Кочетков Г.А., 1980]. Геморрагическую активность АК определяли на крысах самцах Wistar весом 200-250 г [Hobbelen P.M. и др., 1987].

Оценка значимости различий двух средних арифметических рядов экспериментальных данных проводили по t критерию Стьюдента. Для определения связи между двумя признаками в рядах экспериментальных данных использовали корреляционный анализ, для определения достоверности вывода о влиянии фактора на результативный признак F использовали дисперсионный анализ [Дюк В., 1997]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Biostat, SSPS, StagraphicsPlus.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Влияние аминополисахаридов - низкомолекулярных гепаринов (НМГ) и сульфатированных хитозанов (СХ) на свертывание крови человека и экспериментальных животных in vitro и in vivo..

1. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью ферментативного гидролиза нефракционированных гепаринов.

Для выбора перспективносго НМГ анализировали АК активность гепаринов, полученных деполимеризацией НФГ разных фирм производителей, из тканей крупного рогатого скота (КРС) или свиней, с использованием хитинолитического, протеолитического, целлюлолитического ферментных комплексов (ФК) или протеолитических ферментов. Критериями отбора перспективных образцов НМГ служили: аХа активность не менее 70 ЕД/мг и отношение активностей аХа/aIIa более 1. На рис.1. приведена АК активность некоторых (получены деполимеризацией НФГ впервые использованным с этой целью хитинолитическим ФК продуцируемым штаммом Streptomyces kurssanovii) НМГ. Антитромбиновая активность НМГ с ММ 1,6- 7,4 кДа уменьшается в 3-25 раз (в сравнении с НФГ) со снижением ММ (r = 0,75-0,97; p<0,05). Активность против активированного фактора Х достигает 170-190 ЕД/мг, отношение активностей аХа/aIIa - более 4. Величина аХа активности полученных НМГ возрастает с увеличением ММ при гидролизе НФГ из слизистой оболочки кишечника свиней (r=0,88); в значительно меньшей степени подобная связь прослеживается для НМГ, полученных гидролизом НФГ из легких КРС (r=0,35). Максимальное отношение активностей аХа/aIIa у НМГ, полученных деполимеризацией НФГ их легких КРС в 1,5 раза больше, чем у гепаринов, полученных деполимеризацией НФГ из слизистой оболочки кишечника свиней. Однако в диапазоне ММ 1,6-2,7 кДа аХа активность НМГ из слизистой кишечника свиней больше, чем у НФГ; то есть, на АК активность НМГ (в указаннных пределах ММ) влияет тип ткани НФГ. Количество и состояние (иммобилизованный или в растворе) ФК, а также время действия и температурный режим играют роль при получении антикоагулянтов с высокой активностью.





Рис. 1 Антикоагулянтная активность некоторых низкомолекулярных гепаринов (НМГ), полученных гидролизом нефракционированных гепаринов (НФГ) хитинолитическим ферментным комплексом (ФК) Streptomyces kurssanovii (содержит четыре хитиназы, хитозаназу, N-ацетил-D-глюкозоаминидазу и протеазу; иммобилизован на силохроме); по оси Х – молекулярная масса, кДа; * - (p<0,05- 0,001) достоверность различий с антикоагулянтной активностью НФГ.





Рис. 2 Антикоагулянтная активность НМГ, полученных гидролизом НФГ из легких КРС (ОАО "Синтез”) ФК протеаза С (на основе штамма Acremonium chrysogenum; в состав входят сериновая протеаза I, сериновая протеаза II, нейтральная протеаза, карбоксипептидаза, аминопептидаза ) иммобилизованным на поливиниловом спирте; * - (p<0,05- 0,001) достоверность различий с АК активностью НФГ.

При снижении ММ НМГ до 3,4-5,8 кДа, полученных гидролизом НФГ из легких крупного рогатого скота протеолитическим ФК протеаза С, достоверно снижается аIIa активность, аХа активность возрастает и максимум составляет 208±9 ЕД/мг; отношение активностей аХа/aIIa достигает 1,5-2,5 раза (рис. 2).

Анти Ха активность НМГ, полученных гидролизом НФГ папаином составляет – 140-220 ЕД/мг (рис.3). Отношение активностей при гидролизе иммобилизованными ферментами достигает 1,3. Однако при гидролизе ферментами в растворе отношение активностей аХа/aIIa возрастает до 1,7-2,5 за счет снижения аIIa активности.

Отношение активностей аХа/aIIa НМГ полученных гидролизом НФГ из легких КРС химотрипсином и целловиридином [ФК карбогидраз целлюлолитического действия штамма Trichoderma reesei (viride)] составляет 1,3, хотя максимальная аХа достигает 160-180 ЕД/мг. НМГ с ММ 6,8 и 9,3 кДа, полученные гидролизом НФГ лизоцимом, продемонстрировали отношения активностей 1,3. Некоторые авторы в работах последних лет рассматривают преимущества НМГ с оптимальными ММ в диапазоне 9 - 12 кДа, так называемые гепарины со средней ММ (СМГ). Геморрагическая активность СМГ несколько выше, чем у НМГ, но их АК активность успешнее нейтрализуется, что увеличивает безопасность таких лекарственных средств [Alban S. и др., 2002].






Рис. 3 Антикоагулянтная активность НМГ, полученных гидролизом НФГ из легких крупного рогатого скота (ОАО "Белмедпрепарат”) папаином; по оси Х – молекулярная масса, кДа; * - (p<0,05- 0,001) достоверность различий с АК активностью НФГ.

Таким образом, для получения НМГ с отношением активностей аХа/aIIa больше 1 (в основном, за счет снижения антитромбиновой активности) можно использовать для гидролиза НФГ (из легких крупного рогатого скота или слизистой оболочки кишечника свиней) неспецифические ферментные комплексы и ферменты. Способность ингибировать активированный фактор Х, у некотрых фракций НМГ, в сравнении с исходными НФГ достоверно увеличивается на 8 – 13 %. Это может свидетельствовать о том, что при гидролизе НФГ использованными неспецифическими ФК и ферментами не затрагиваются последовательности сахаридов, ответственные за связь с плазменным ингибитором сериновых протеаз – антитромбином [Bisio A. и др., 2009]. Снижение антитромбиновой активности НМГ с уменьшением ММ закономерно [Atkinson H.M. и др. 2009].

Для определения возможности комплексообразования между полученными НМГ (гидролиза НФГ ФК Streptomyces kurssanovii или протеаза С) и поликатионами [хитозан (СД 61-85% и ММ 4-21 кДа) и сульфат протамина (ПСТ)] использовали биоспецифичный электрофорез и турбидиметрическое титрование. Добавляя факции НМГ в лунки геля агарозы с поликатионами наблюдаем пики преципитации комплексов полианион-поликатион, появляющиеся в результате электрофореза [Weeke B., 1973]. На рис. 4 и 5 показаны сканированные изображения пиков преципитации после электрофореза. Размеры пиков преципитации (высота и площадь) тесно коррелируют с ММ и специфическими АК активностями НМГ (rмм= 0,6-0,93; raIIa=0,55-0,92; rаХа= 0,73- 0,93), что предполагает применение этого метода для выбора наиболее активных НМГ, при анализе большого количества образцов. Структурные характеристики поликатионов-хитозанов влияют на размеры пиков преципитации. Так, с увеличением ММ при СД 85% и с увеличением СД при ММ 21 кДа увеличивается высота пиков преципитации. При анализе результатов турбидиметрического титрования показано, что с увеличение степени дезацетилирования хитозанов увеличивается сила положительной связи с ММ исследуемых НМГ. Для появления комплексов на 1 мг НМГ требуется 0,8 – 1,4 мг ПСТ и хитозанов. Определение связи между ММ, антикоагулянтной активностью НМГ, структурными характеристиками хитозанов и размерами пиков преципитации позволило выбрать наиболее оптимальные поликатионы.

Известно, что ПСТ частично нейтрализует АК активность НМГ, используемых в клинической практике [Crowther M.A. и др., 2002]. Однако ПСТ полностью нейтрализует аХа и aIIa активности НМГ с ММ 4,7; 5,1 и 7,4 кДа (получены гидролизом НФГ ФК S. kurssanovii) в исследованиях с применением амидолитических тестов; гравиметрическое отношение антидот : антикоагулянт= (0,7 -1):1.

Но при нейтрализации ингибирования НМГ с ММ 7,0 кДа [гидролиз НФГ лизоцимом) фибриногенсвертывающей активности тромбина (гравиметрическое отношение антидот:антикоагулянт= (0,5 -1):1] остаточная aIIa активность составила 20%, по отношению к контролю, что совпало с данными по нейтрализации антитромбиновой активности НФГ.

Хитозан с ММ 21 кДа и СД 61% нейтрализует ингибирование НМГ с ММ 7,0 кДа (гидролиз НФГ лизоцимом) фибриногенсвертывающей активности тромбина. Антитромбиновая активнотсь НМГ-7,0 снижается более, чем в 1,5 раза, при весовом отношении поликатион: полианион = 0,3. Хитозаны с ММ 16 и 21 кДа (степень дезацетилирования 91 и 61%) нейтрализуют на 25-100% ингибирование НМГ с ММ 2,7 – 7,4 кДа и НФГ амидолитической активности тромбина. Таким образом, aIIa и аХа активности некоторых полученных НМГ можно нейтрализовать ПСТ и хитозанами с ММ 16 и 21 кДа в амидолитических и коагулологических тестах. Нейтрализация осуществляется за счет появления комплексов поликатион – полианион.







A

Б

1а 1б 1в 2а 2б 2в 3а3б3в 4а 4б 4в 5а 5б 5в



Рис. 4. Электрофорез гепаринов в агарозном геле с сульфатом протамина (А) и хитозаном (В, ММ 16 кДа, СД=-91%); количество АК в лунках: a-1,25 мкг, b-2,5 мкг; номер лунки: 1- НФГ 15 кДа; 2- НМГ 5,1 кДа; 3- НМГ 7,4 кДа; 4- 4,7 кДа; 5- 4,0 кДа; 6-2,7 кДа.

Рис. 5. Электрофорез гепаринов с хитозанами в геле агарозы (А - хитозан-HCl, СД 85%, ММ 10 кДа; Б - хитозан-HCl,СД 93%, ММ 7,4 кДа); номер лунки: 1- НФГ 14 кДа; 2- НМГ 7,4 кДа; 3- 5,1 кДа; 4- 4,7 кДа; 5 – 4,0 кДа; концентрация АК в лунках: а - 0,25; б - 0,5; в – 1 мг/мл.

На основе патента (№ 2221578 от 24.10.2002 г. “Способ получения очищенного активированного фактора Х свертывания крови”), полученного нами в соавторстве с сотрудниками лаборатории стандартизации методов контроля препаратов плазмы ГНЦ РАМН разработан набор “РеаХром-гепарин” (НПО “Ренам”) позволяющий определять аХа активность плазмы при введениях НМГ экспериментальным животным и человеку, а также оценивать удельную аХа активность разрабатываемых НМГ и других соединений. Достоверность определений аХа активности с помощью набора “РеаХром-гепарин” НПО Ренам, в сравнении с определениями набором Berichrom heparin (Dade Behring), подтверждается статистическими параметрами, обычно используемыми в исследованиях такого рода.

Фармакодинамические (ФД) параметры НМГ с ММ 4,7 кДа и 5,4 кДа (НМГ-4,7; НМГ-5,4 при в/в введении кроликам в дозах 0,3 – 3,0 мг/кг и при п/к введении в дозах 3 – 30 мг/кг ) и НМГ-6,8 (при п/к введении в дозах 70 – 300 аХа ЕД/мг) по аIIa, аХа активностям и времени свертывания плазмы в тестах ВСК и АЧТВ соответствуют ФД параметрам коммерческого НМГ эноксапарина [Alban S. и др., 2002] и совпадают с ФД параметрами фраксипарина, который использовали для сравнения. Сравнение отношений аХа/aIIa активностей плазмы кроликов после п/к введения исследуемых НМГ с отношением специфических активностей показало увеличение первых до 0,87-1,74 (для НМГ-4,7), 0,98-10,46 (для НМГ-5,4) и 1,25-3,44 (для НМГ-7,0). Подобное может свидетельствовать о возможном влиянии этих АК на выброс из эндотелия сосудов ингибитора внешнего пути свертывания [Harenberg J. И др., 2002]; известно, что уровень этого ингибитора в плазме повышается в 2-4 раза при п/к или в/в введении НМГ [Demirkan A. и др., 2002].





Рис. 6. Антитромботическая активность низкомолекулярных гепаринов

НМГ-4,7 (aIIa - 68±8 ЕД/мг; аХа - 155±23 ЕД/мг; отношение активностей аХа/aIIa – 2,3), НМГ- 5,4 (aIIa - 110±11 ЕД/мг; аХа - 168±19 ЕД/мг; отношение активностей аХа/aIIa – 1,53) и НМГ-6,8 (aIIa - 115±13 ЕД/мг; аХа - 152±10 ЕД/мг; отношение активностей аХа/aIIa – 1,32) в одинаковой степени и также эффективно, как и фраксипарин, препятствуют развитию экспериментального тромбоза у крыс (рис. 6). Такие показатели как: форма тромба в баллах, вес влажного тромба, содержание белка при дозах 39 - 390 ЕД/кг у НМГ-4,7 и НМГ- 5,4, сопоставимы с такими же показателями для фраксипарина. По всей вероятности, НМГ-4,7 и НМГ-5,4 обладают сравнимой противотромботической активностью в силу того, что НМГ-4,7 имеет меньшую величину специфических активностей, но большее соотношение активностей аХа/aIIa, а НМГ-5,4 – несмотря на меньшее отношение активностей аХа/aIIa демонстрирует большую величину специфических активностей. Геморрагическая активность НМГ с ММ 4,7; 5,4 кДа и фраксипарина одинакова.

Таким образом, деполимеризация НФГ из легких КРС или слизистой оболочки тонкого кишечника свиней посредством неспецифических гидролаз, приводит к получению образцов НМГ с высокими аХа активностями до 150 -200 ЕД/мг, что сравнимо с аХа активностью коммерческих НМГ. За снижением ММ НМГ следует снижение aIIa активности и увеличение отношения активностей аХа/ аIIa до 4. Использование биоспецифичного электрофореза, способа фиксирования комплексов между гепаринами и сульфатом протамина/хитозанами (СД 61-85% и ММ 6-21 кДа), облегчает выбор эффективного антидота. Специфическую АК активность полученных НМГ можно успешно нейтрализовать с помощью сульфата протамина. Обнаружен образец хитозана, который частично (на 42%) нейтрализует аIIa активность НМГ (в весовом соотношении 3:1). С увеличением дозы НМГ-4,7 (гидролиз S. kurss.), НМГ-5,4 (гидролиз протеазой С) и НМГ-6,8 (гидролиз лизоцимом) увеличиваются аIIa и аХа активности плазмы кроликов при в/в и п/к введениях. При п/к введении полученных НМГ кроликам период полувыведения сопоставим с периодом полувыведения фраксипарина в одинаковых дозах. Антитромботическая и геморрагическая активности НМГ-4,7 (гидролиз НФГ S. kurss.) и НМГ-5,4 (гидролиз НФГ протеазой С) сравнимы с таковыми у фраксипарина. В 2008 г. осуществили первый этап токсикологических испытаний НМГ-6,8 по программе Фармкомитета в лаборатории лекарственной токсикологии НИИЭК ФГУ «РКНПК» Росздрава. Социально-экономическая значимость результатов бесспорна, так как НМГ-6,8 может быть в 3-8 раз дешевле существующих на рынке Российской Федерации импортируемых НМГ.


<< предыдущая страница   следующая страница >>
Смотрите также:
Выявление новых антикоагулянтов прямого действия в ряду органических соединений различной химической структуры 14. 03. 06. фармакология, клиническая фармакология
699.38kb.
4 стр.
Сравнительная оценка специфической фармакологической активности различных гемостатических средств местного и системного действия 14. 00. 25 фармакология, клиническая фармакология 14. 00. 29. гематология и переливание крови
308.29kb.
1 стр.
Эндотелиальная дисфункция и пути ее фармакологической коррекции 14. 03. 06. фармакология, клиническая фармакология
754.56kb.
5 стр.
Банк данных Клиническая фармакология 288935 615. 03 Б438 Белоусов, Юрий Борисович
197.78kb.
1 стр.
Роль и место ингибиторов I f каналов синусового узла в лечении больных ибс с синдромом бронхиальной обструкции 14. 03. 06 фармакология, клиническая фармакология
671.68kb.
4 стр.
Антиметастатическая активность препаратов природного происхождения 14. 00. 25 фармакология, клиническая фармакология
1023.31kb.
4 стр.
Фармакологическая модуляция сигнальной функции na +,K + -атфазы 14. 03. 06 фармакология, клиническая фармакология 03. 03. 01 физиология
619.23kb.
6 стр.
Фармакологический анализ участия гамма аминомасляной кислоты в эффектах антигипоксантов на тревожность и когнитивные функции при экспериментальном невротическом состоянии 14. 03. 06 фармакология, клиническая фармакология
418.99kb.
4 стр.
Фаррингтон э гомеопатическая клиническая фармакология
3572.45kb.
25 стр.
Фармакотерапия нарушений высшей нервной деятельности при дисбалансе эстрогенов (экспериментальное исследование) 14. 00. 25 фармакология, клиническая фармакология
703.65kb.
5 стр.
Использование азотсодержащих кремний- и карбофункциональных органических соединений в синтезе линейных и гетероциклических продуктов 02. 00. 08 Химия элементоорганических соединений
270.19kb.
1 стр.
Фармакоэпидемиологическое и фармакоэкономическое обоснование лекарственного обеспечения специализированной помощи при ожоговой травме 14. 03. 06 фармакология, клиническая фармакология 14. 02. 03 общественное здоровье и здравоохранение
316.92kb.
1 стр.